中藥降糖復方對KK-Ay小鼠糖尿病腎病的影響*

洪金妮，王學美，富 宏，張 寧，黎巍威

(北京大學第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究室，北京 100034)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素分泌不足和/或作用缺陷引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，近年來在我國發(fā)生率高達25%～40%[2]，但治療手段十分有限。中藥降糖復方是北京大學第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科王學美教授在臨床上治療2型糖尿病的常用方，具有清熱活血、益氣養(yǎng)陰的功效。本課題組前期通過單中心隨機對照臨床研究證實，中藥降糖復方可有效降低患者空腹及餐后血糖[3]，減少西藥服用量，有效降低糖尿病模型小鼠KK (KK-Ay小鼠)尿蛋白，改善腎小球細胞和基質(zhì)增生等病變，減少糖基化終末端產(chǎn)物及氧化應激[4]，激活磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3 K) / 蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的信號通路，抑制核因子κB(NF-κB)的信號通路，降低炎癥反應[5]，改善糖尿病癥狀。但中藥降糖復方是否具有改善KK-Ay小鼠血糖、血脂及腎功能的作用有待進一步研究。本文通過研究中藥降糖復方顆粒劑對KK-Ay小鼠血糖、血脂、尿液生化、腎臟病理等影響，探討其對2型糖尿病引起的糖尿病腎病的療效及作用機制，對中藥復方的進一步開發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 動物

雄性自發(fā)性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠50只，9周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號SCXK(京)2014-0004)；健康雄性C57BL/6 J小鼠10只，9周齡，北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證編號SCXK(京)2012-0001)。KK-Ay小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號SCXK(京)2014-0008)；C57BL/6 J小鼠普通飼料飼養(yǎng)。所有動物自由飲水，在室溫(22±1)℃、12 h光照周期SPF環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周。尾尖取血測KK-Ay小鼠餐后血糖(postprandial blood sugar，PPBS)≥11.1 mmol·L-1或空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)≥7.0 mmol·L-1即視為糖尿病模型。

1.2 藥物

地錦草(Humifuseeuphorbiaherb)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、生黃芪(RawRadixAstragalis)、知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)、黃連(RhizomaCoptidis)顆粒劑均購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，藥物比例為3∶4∶2∶2∶1，用雙蒸水配置成生藥濃度為0.2 g生藥·mL-1、0.4 g生藥·mL-1和0.8 g生藥·mL-1備用。取鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)1 g溶于40 ml 雙蒸水中，制成25 g·L-1的陽性給藥液，灌胃體積均為0.01 ml·g-1/體質(zhì)量。

1.3 試劑及儀器

精蛋白鋅重組人胰島素注射液(中效型，優(yōu)泌林，美國禮來公司)；甘油三酯測定試劑盒(GPO-PAP法，中生北控生物科技股份有限公司)；總膽固醇測定試劑盒(COD-PAP法，中生北控生物科技股份有限公司)；尿素氮測試盒(南京建成生物工程研究所)；肌酐測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；尿蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠糖基化終末端產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)檢測試劑盒(Abbexa，批號L201610A346)；小鼠糖基化終末端產(chǎn)物受體(receptor of glycation end products，RAGE)檢測試劑盒(R&D)；羅康全卓越型血糖儀(瑞士羅氏公司，批號P103593)；infinite M200酶標儀(瑞士TECAN公司)；VELOCITY-18R型離心機(澳大利亞 Dynamica公司)；MB100-2 A型微孔板恒溫振蕩器(杭州奧盛儀器有限公司)；ES-1100(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥

將KK-Ay小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍組、中藥低濃度組、中藥中濃度組和中藥高濃度組5組各10只，以C57BL/6 J小鼠為正常對照組。其中二甲雙胍組灌胃鹽酸二甲雙胍(250 mg·kg-1/體質(zhì)量)，中藥低濃度組、中藥中濃度組、中藥高濃度組分別按2 g·kg-1/體質(zhì)量、4 g·kg-1/體質(zhì)量、8 g·kg-1/體質(zhì)量灌胃中藥降糖復方顆粒劑，正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次共12周。

2.2 檢測方法

2.2.1 血糖檢測及口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT) 餐后血糖：在小鼠不禁食的情況下，于給藥0周、4周、8周、12周時的固定時刻尾尖采血10～20 μl，采用葡萄糖氧化酶法檢測；口服葡萄糖耐量試驗：小鼠禁食4 h，尾尖取血測血糖，灌胃高濃度葡萄糖0.2 g·ml-1(2 g·kg-1/體質(zhì)量)，0 min(FBG)、30 min(BG30)、60 min(BG60)、120 min(BG120)時間點測血糖繪制血糖曲線，計算曲線下面積AUCg=(FBG+BG30)×0.5÷2+(BG30+BG60)×0.5÷2+(BG60+BG120)×0.5÷2。OGTT在給藥0周、4周、8周、12周檢測共4次。采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

2.2.2 血生化檢測 小鼠禁食4 h尾尖取血，檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血清肌酐(Cr)、血清尿素氮(BUN)。甘油三酯采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)檢測法，總膽固醇采用膽固醇氧化酶-過氧化物酶(COD-PAP)檢測法，血清肌酐采用肌氨酸氧化酶法，血清尿素氮采用脲酶法檢測，均按照相關說明書操作。在給藥0周、4周、8周、12周時檢測共4次。

2.2.3 尿樣收集及檢測 將小鼠放入小鼠代謝籠飼養(yǎng)24 h，并收集24 h尿量，共收集500～1000 ml尿液，4500 r·min-1離心10 min，-80 ℃凍存。在給藥0周、4周、8周、12周放入代謝籠共4次。用相應試劑盒檢測尿肌酐、尿素氮、尿蛋白，分別采用肌氨酸氧化酶法、脲酶法、考馬斯亮藍(CBB)法。

2.2.4 腎臟病理檢查 灌胃12周后，將小鼠空腹8 h后處死，取小鼠一側(cè)腎皮質(zhì)放置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，制成3 μm石蠟切片，HE染色后采用OLYMPUS DY07顯微鏡觀察腎臟形態(tài)學變化。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠血糖的影響

3.1.1 空腹血糖 表1顯示，中藥降糖復方能明顯改善KK-Ay的空腹血糖。所有入選KK-Ay小鼠均已成模，模型組血糖在造模成功后一直處于高血糖狀態(tài)。與模型組比較，給藥4周后所有給藥組均能降低血糖，但差異無統(tǒng)計學意義；給藥8周后，二甲雙胍及低中濃度組能明顯改善小鼠空腹血糖(P<0.001)，其中中藥低中濃度組效果優(yōu)于高濃度組；給藥12周后，二甲雙胍及所有中藥組能明顯改善小鼠空腹血糖(P<0.01)，低中濃度組的血糖低于高濃度組，但降糖效果次于陽性藥組。

表1 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠空腹血糖的影響

注：與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.1.2 餐后血糖和口服葡萄糖耐量試驗 表2顯示，中藥降糖復方能明顯改善KK-Ay的餐后血糖和口服葡糖萄糖耐量。與模型組比較，給藥4周后二甲雙胍及所有給藥組均能明顯改善小鼠餐后血糖(P<0.01)；給藥8周、12周后，各給藥組均能有效降低小鼠餐后血糖，且中藥各給藥組降低血糖的效果優(yōu)于二甲雙胍組，低濃度組效果最明顯。給藥12周后，與模型組比較中藥低中高濃度組降低口服葡糖糖耐量試驗曲線下面積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低濃度組效果最明顯(P<0.001)。

表2 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠餐后血糖、口服葡糖糖耐量曲線下面積的影響

注：與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.2 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠腎功能影響

表3顯示，中藥降糖復方能在一定程度改善小鼠腎功能。與對照組比較，模型組血清和尿液中的BUN、Cr及尿蛋白水平均有所上升。與模型組比較，給藥12周后二甲雙胍及各給藥組均能在一定程度上降低血清中的BUN和Cr，其中中濃度組和高濃度組降低血清中BUN差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高濃度組降低血清中Cr更為顯著(P<0.05)；給藥12周后二甲雙胍及各給藥組均能降低尿液中的BUN、Cr和尿蛋白，與模型組比較，中濃度組和高濃度組降低尿中Cr和尿蛋白差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠腎功能的影響

注：與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.3 中藥降糖復方對KK-Ay小鼠血脂和尿液、飲水、攝食量的影響

表4顯示，中藥降糖復方能改善KK-Ay小鼠甘油三酯和總膽固醇，低、中濃度療效較佳。與對照組比較，模型組TG和TC明顯上升。與模型組比較，給藥12周后二甲雙胍及中藥低、中濃度組能在一定程度上降低小鼠血脂，其中中濃度組降低TC差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。復方還能改善小鼠的多飲多食多尿癥狀。給藥12周后，二甲雙胍組及中藥低濃度組能顯著減少小鼠尿量(P<0.05)；二甲雙胍組及各給藥組能在一定程度上減少小鼠攝食量和飲水量，且成一定的濃度依賴性。

3.4 中藥降糖復方對小鼠血清中AGEs和RAGE的影響

表5顯示，中藥降糖復方能降低KK-Ay小鼠血清中糖基化終末端產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)及糖基化終末端產(chǎn)物受體(receptor of glycation end products，RAGE)的沉積。給藥12周后，與模型組比較中藥中、高濃度組能顯著降低小鼠血清中AGEs含量(P<0.05)，效果優(yōu)于二甲雙胍組；給藥12周后，二甲雙胍組及中藥中、高濃度組能顯著降低小鼠血清中RAGE含量(P<0.01)。

表4 灌胃12周后中藥降糖復方對KK-Ay小鼠TG、TC、尿量、攝食量及飲水量的影響

注：與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

表5 灌胃12周后中藥降糖復方對KK-Ay小鼠血清中AGEs及RAGE的影響

注：與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

3.5 HE染色觀察中藥降糖復方對腎臟影響

圖1顯示，中藥降糖復方能在一定程度上改善糖尿病腎病小鼠腎臟的組織形態(tài)學病變。通過HE染色，可觀察到模型組中腎小球毛細血管擴張，充滿大量紅細胞(虛線箭頭)，腎小囊內(nèi)血漿蛋白大量滲出，腎小球系膜細胞增生。而正常組和給藥組可見腎小球結(jié)構(gòu)相對正常(實線箭頭)，腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小囊壁層均勻，細胞排列整齊，堆積聚攏現(xiàn)象較少，腎小球系膜細胞增生較輕，腎小球毛細血管無或輕度擴張，偶爾可見少量紅細胞(虛線箭頭)，腎小囊內(nèi)血漿蛋白滲出較少或無。從圖中可見，用藥后，腎小球毛細血管擴張情況明顯好轉(zhuǎn)，紅細胞和血漿蛋白溢出明顯減少。

圖1 灌胃12周后中藥降糖復方對KK-Ay小鼠腎臟HE染色的影響(n=10)

4 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是導致腎衰竭的首要原因。AGEs途徑是糖尿病的經(jīng)典發(fā)病學說。AGEs是持續(xù)高血糖狀態(tài)下，葡萄糖與各種蛋白質(zhì)結(jié)合非酶糖基化反應形成的終末產(chǎn)物。近年來研究認為，AGEs在腎臟局部堆積可通過多種直接和間接途徑參與糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)的發(fā)生發(fā)展[3]。AGEs與RAGE結(jié)合能改變蛋白結(jié)構(gòu)功能，降低酶活性，引起基質(zhì)蛋白交叉連接，導致腎臟細胞功能、組織結(jié)構(gòu)異常；另一方面，二者結(jié)合后可激活NF-κB信號通路引起炎癥因子釋放，損傷腎臟組織。在糖尿病患者的腎臟中，AGEs的大量聚集刺激系膜細胞表面的AGEs受體，使層黏連蛋白及其他腎小球系膜結(jié)構(gòu)蛋白明顯增加，最終致系膜區(qū)擴張，腎小球基膜增厚，加速腎小球硬化[4]。

糖尿病腎病的治療手段十分有限，主要通過控制飲食、血糖血脂血壓等延緩疾病進展。近年來隨著研究的深入，有學說認為糖尿病腎病是一種炎癥性疾病[6-7]。有研究報道[8]，清熱解毒中藥可以改善糖尿病腎病癥狀、降低血糖、改善微循環(huán)、保護腎功能，其作用機制可能與抑制炎癥反應因子、糖基化終末產(chǎn)物、影響腎素血管緊張素系統(tǒng)、改善脂代謝紊亂等有關。近年來，隨著2型糖尿病臨床研究和分子生物學炎癥機制研究的不斷深入，其“熱毒”病機與清熱解毒治法在臨床中的應用得到重視。而劉完素[9]、張從正[9]、郭士魁[10]、施今墨[11]、祝諶予[12]等大家也均重視應用清熱解毒法治療糖尿病。

中藥降糖復方以“熱毒”立論，采用地錦草、黃芪、黃連、丹參、知母等中藥組方配伍成清熱活血、益氣養(yǎng)陰的方劑，其中地錦草性平、味辛微苦澀，善清熱解毒、利濕降濁具有活血涼血之效，與黃連共為君藥；丹參活血化瘀、清心除煩可輔君藥化瘀降濁為臣；黃芪補脾益氣，知母清熱養(yǎng)陰共為佐使。近年來，眾多單味藥、單體被證實能有效防治糖尿病及其并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，地錦草能有效改善KK-Ay的空腹血糖和胰島素抵抗[13]；丹參的主要成分丹酚酸B能提高胰島B細胞數(shù)量，改善胰島結(jié)構(gòu)和功能[14]；黃芪能降低血糖，改善口服葡萄糖耐量和胰島素抵抗[15]；知母能改善2型糖尿病大鼠的血糖血脂水平[16]；黃連能改善葡萄糖的非酶促糖基化反應，二羥基化合物的形成以及糖基化終末端產(chǎn)物的形成[17]。

本研究通過動物實驗觀察中藥降糖復方顆粒劑對自發(fā)糖尿病KK-Ay小鼠血糖、血脂、尿液、飲食、飲水量、腎臟形態(tài)學等的影響。實驗結(jié)果顯示，中藥降糖復方顆粒劑能在一定程度上改善KK-Ay小鼠空腹血糖、餐后血糖、口服葡萄糖耐量、血清和尿液中肌酐、尿素氮等相關指標，同時通過HE染色發(fā)現(xiàn)，中藥降糖復方能在一定程度上緩解腎小球毛細血管擴張、腎小囊內(nèi)血漿蛋白滲出等組織形態(tài)學，證實中藥降糖復方能改善糖尿病腎病。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，中藥降糖復方能降低小鼠血清中AGEs和RAGE，提示中藥降糖復方顆粒劑可改善KK-Ay小鼠糖尿病腎病的機制可能與降低體內(nèi)AGEs和RAGE有關。中藥降糖復方可能通過降低血糖，減少葡萄糖與蛋白質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應，直接或間接減少AGEs的沉積，從而改善糖尿病腎病，其具體機制有待進一步研究。