雙參通脈顆粒對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

陳 卓，李文杰，楊 鶯

(1. 遼寧中醫藥大學，沈陽 110847； 2. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032)

心肌梗死是中老年人心血管系統病變中最嚴重的致死因素。近年來，介入治療廣泛應用于急性心肌梗死，因此如何改善心肌缺血再灌注損傷成為亟待解決的問題。雙參通脈顆粒具有益氣養陰、活血通絡的功效。本實驗通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法制備心肌缺血模型，以研究雙參通脈顆粒對大鼠缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 雙參通脈顆粒(ginseng and salvia granules for promoting blood flow，GSG)(遼寧中醫藥大學附屬醫院院內制劑)主要成分組成：人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當歸；合心爽(鹽酸地爾硫卓片，Diltiazem hydrochloride，DH)(天津田邊制藥有限公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)；過氧化氫酶(Catalase，CAT)、內皮素-1(Endothelin -1，ET-1)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)；酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(凱基生物有限公司)，核轉錄因子-κB(Nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)，IκB激酶β(Inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ)抗體(美國Cell Signaling公司)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海前塵生物科技公司)；4%多聚甲醛、蛋白酶K、PBS緩沖液、0.1 M枸櫞酸緩沖液(上海前塵生物科技公司)等。

1.1.2 實驗儀器 MP150多導生理信號采集系統(德國Leica公司)、高速臺式離心機(德國Eppdendorf公司)、BB23型培養箱(美國PE公司)、ROTEAN電泳系統(美國Bio公司)、冰凍切片機OM3123型(瑞典Bio公司)、恒溫恒濕箱(上海科技生物公司)、多功能酶標儀(美國Cell Signaling公司)等。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血模型的復制 健康SD大鼠40只，術前禁食12 h，參照文獻[1]方法造模：2.5%戊巴比妥腹腔注射，麻醉成功后大鼠仰臥位固定于手術臺，氣管切開，呼吸機輔助呼吸(頻率85次/min,潮氣量18 ml,呼吸比1∶1)，連接心電檢測儀，術中記錄Ⅱ導聯心電圖。頸部、心前區剪毛，碘伏消毒，于胸骨左側第3肋間切口，逐層鈍性分離皮下組織，沿肋間分離肋骨，進入心包暴露心臟，左右各上一眼科用小拉鉤使心臟暴露充分，找到左心耳，于肺動脈圓錐與左心室交界處下方確定結扎位置，以6-0號帶線縫合針在冠狀動脈左前降支(Left anterior descending coronary artery，LAD)下方2 mm處結扎，進針深度約2 mm，心電圖監測到ST段抬高0.2mv左右即為造模成功，持續30 min后打開結扎線，再灌注120 min。關胸并抽出胸腔積氣積液，拔出引流管。

1.2.2 實驗動物分組與給藥 健康成年SD大鼠，體質量280～300 g，按隨機數字表法分為6組各10只。假手術組(sham operation group，Sham)：生理鹽水灌胃，每日1次，連續4周，只開胸不結扎；模型組(myocardial ischemia reperfusion injury group，MIRI)：生理鹽水灌胃，每日1次，連續4周，開胸結扎LAD30 min，再灌注120 min；合心爽治療組(diltiazem hydrochloride group，DH)：DH灌胃，4.23 mg/kg，每日1次，連續4周，開胸結扎LAD30 min，再灌注120 min；雙參通脈顆粒低劑量組(GSG-L)：GSG灌胃，按大鼠體表面積給藥，相當于生藥量6.34 g/kg，每日1次，連續4周，開胸結扎LAD30 min，再灌注120 min；雙參通脈顆粒中劑量組(GSG-M)：給藥方法同上，相當于生藥量11.16 g/kg；雙參通脈顆粒高劑量組(GSG-H)：相當于生藥量15.62 g/kg。

1.2.3 血流動力學測定 取材前分離右側頸總動脈，左心導管插管至左心室，由 ALC-MPA 多導生物信號分析系統記錄血流動力學參數。

1.2.4 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO測定 經腹主動脈負壓采血 2～10 ml,3000 r/min離心取血清試管編號，ELISA法檢測血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量。按試劑盒說明書進行操作：將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度，5%小牛血清置37 ℃封閉40 min，洗滌液滿孔洗滌3遍各3 min，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中,每樣品至少加雙孔，37 ℃ 40～60 min，加入酶標抗體，37 ℃ 30～60 min，加入底物液，37 ℃避光放置3～5 min,加入終止液顯色，20 min內測定實驗結果。

1.2.5 心肌組織病理觀察 取左心室中部心肌組織連續2 塊厚約2～3 mm，標本固定于4%多聚甲醛中，觀察時各級乙醇脫水，石蠟固定進行常規切片，再于二甲苯、各級乙醇中脫水，蘇木精-伊紅(HE)染色，二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察左心室組織學改變。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 心肌組織石蠟包埋、切片、脫水、蛋白酶孵育，加TUNEL反應液，37 ℃靜置1 h，加DAB蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片。顯微鏡下正常心肌細胞核藍色，凋亡細胞核為棕褐色。每張切片于相同區域選取5個高倍視野計數，所占總細胞數百分比即為凋亡指數。

1.2.7 心肌NF-κB、Iκκβ蛋白表達 組織蛋白提取：取組織塊加液氮研磨，加入RIPA 裂解液，漩渦混勻放置1 h，4℃ 13000 r離心20 min，檢測蛋白濃度，計算需要的蛋白上樣量，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，電壓100 V，恒壓轉膜90 min，將蛋白轉移到硝酸纖維膜上。轉膜完成用牛奶封閉1 h，再用 PBST溶液洗膜3次，每次7 min；加入一抗孵育4 h，PBST洗膜3次，每次7 min。加入溶有鼠或兔二抗的牛奶孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加顯色液顯色，在暗室中顯影，用ImageJ軟件進行western blot蛋白定量分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠造模前后Ⅱ導聯心電圖(ECG)變化

圖1顯示，各組大鼠給予左冠狀動脈前降支結扎后ECGST段均有不同程度升高，介于0.1～0.3 mv之間，證明各組大鼠心肌缺血模型復制成功。

2.2 左心室功能檢測

表1顯示，治療結束后大鼠各項血流動力學參數都發生了改變，反映左心室收縮功能的指標(Left ventricular systolic function,LVSF)明顯降低(P<0.05)，反映左心室舒張功能的指標(Left ventricular diastolic function，LVDF)顯著升高(P<0.05)；各組心率(Heart rate,HR)變化較大，GSG治療后大鼠各項血流動力學參數都有顯著改善，其中高劑量組改善最明顯。

圖1 各組大鼠手術前后Ⅱ導聯ECGST段變化注：A. Sham組；B.MIRI組；C.DH組；D.GSG-L組；E.GSG-M組；F.GSG-H組

組 別鼠數LVSF( mmHg)LVDF( mmHg)HR(t/min)beforeafterD-valueSham10114.1±2.75.7±0.2366.5±1.4382.9±4.117.3±3.3MIRI1090.6±4.3■12.1±0.7■378.1±2.4421.4±1.738.7±5.8■DH10109.3±1.68.3±0.3370.4±5.2387.3±6.116.8±2.1GSG-L10121.5±0.6*6.9±1.7*361.3±3.6374.1±7.611.5±1.4*GSG-M10119.3±3.3*6.1±0.6*360.8±4.2377.6±2.713.1±2.4*GSG-H10124.7±2.9#5.9±1.1#372.1±2.4379.4±3.16.4±4.6#F值7.134#3.264#——4.164#

注：■P<0.05 vs Sham，#P<0.01，*P<0.05 vs MIRI

2.3 心肌組織病理變化

圖2顯示，Sham組：心肌細胞排列緊密、規整、間隙小，未發現有明顯水腫區域存在，肌纖維無明顯扭曲；心肌細胞膜完整、界限清晰、細胞核位置居中，細胞間隙無紅細胞出現，炎癥浸潤；MIRI組：肌纖維扭曲紊亂亦有部分纖維斷裂，細胞腫脹變大，組織間隙增寬，水腫現象明顯，炎細胞浸潤布滿視野，細胞間隙可見大量紅細胞存在，出血情況嚴重，細胞核散亂無規律； DH組：炎細胞浸潤明顯，紅細胞滲出較多，而細胞間的水腫情況有所好轉，肌纖維斷裂現象較少；GSG-L組：與模型組比較損傷顯著降低，顯微鏡下觀察時細胞邊界清晰，輪廓完整，組織間隙仍有不同程度水腫，但整體較輕，紅細胞滲出較多；GSG-M組：心肌細胞排列尚規整，水腫區域較小，肌纖維無斷裂，炎癥不明顯；GSG-H組：細胞邊界輪廓尚清晰，組織間隙有輕微水腫，肌纖維偶有斷裂，紅細胞滲出較少。

2.4 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量變化及心肌細胞凋亡

2.4.1 血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量變化 表2顯示，心肌缺血時ET、MPO含量迅速增加，GSH-PX、CAT含量下降，給予GSG干預后ET、MPO均有下降，GSH-PX、CAT含量上升，與MIRI組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與Sham組比較，MIRI組心肌細胞凋亡指數顯著升高(P<0.05)；與MIRI組比較，DH組心肌細胞凋亡指數明顯下降(P<0.05)；與MIRI組比較，GSG各劑量組心肌細胞凋亡指數明顯下降(P<0.05)。

注：A. Sham組；B. MIRI組；C. DH組；D.GSG-L組；E.GSG-M組；F.GSG-H組圖2 各組大鼠心肌病理炎癥損傷程度變化比較(HE染色，光鏡×200)

表2 GSG對心肌缺血大鼠血清GSH-PX、CAT、ET、MPO影響比較

注：■P<0.05 vs Sham，#P<0.01，*P<0.05 vs MIRI

2.4.2 心肌細胞凋亡 圖3顯示心肌細胞凋亡指數: Sham組心肌組織未見明顯凋亡的細胞；MIRI組心肌組織中凋亡細胞較多、較密集；DH組凋亡細胞較MIRI組減少；GSG-L組凋亡細胞較MIRI組減少；GSG-M組凋亡細胞較GSG-L組減少；GSG-H組凋亡細胞較MIRI組減少。

注：A. Sham組；B.MIRI組；C.DH組；D.GSG-L組；E.GSG-M組；F.GSG-H組圖3 各組大鼠心肌組織細胞凋亡(HE染色，光鏡×200)

2.5 心肌組織NF-κB、Iκκβ蛋白表達

圖4、5顯示，MIRI組NF-κB蛋白表達較Sham組明顯升高(P<0.05)，給予DH及GSG后，各組NF-κB蛋白表達均有不同程度降低(P<0.05)。MIRI組Iκκβ蛋白表達較Sham組明顯降低(P<0.05)，給予DH及GSG后，各組Iκκβ蛋白表達均有不同程度降低(P<0.05)。

注：*P<0.05 vs Sham；#P<0.05 vs MIRI；**P<0.01 vs MIRI圖4 心肌組織NF-κB蛋白表達比較

圖5 心肌組織Iκκβ蛋白表達比較

3 討論

心肌缺血氧化損傷過程中，氧自由基產生過多，炎性介質大量釋放，內皮功能損傷，細胞凋亡[1]。正常狀態下，人體氧自由基生成與清除處于動態平衡，并可以在GSH-PX與CAT的催化下還原成氧和水[2-3],GSH-PX與CAT的含量能夠反映出機體的抗氧化能力。心肌血管內皮損傷貫穿于缺血再灌注損傷的全過程，縮血管物質ET-1含量增高，促進血管收縮，心肌缺血進一步加重，內皮細胞屏障被破壞，中性粒細胞大量浸潤，MPO反映機體內中性粒細胞的活動程度。NF-κB是細胞核內重要的轉錄調節因子，與機體炎癥損傷修復、細胞凋亡相關基因的表達密切相關。在炎癥因子的刺激下，NF-κB通常依賴經典信號途徑被活化[4]，NF-κB的活化可通過Iκκ蛋白調節，主要為Iκκβ[5-6]。

雙參通脈顆粒(GSG)由人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當歸組成，具有益氣養陰、活血通絡的功效[7-8]。現代藥理研究證實，人參皂苷對心血管系統具有明顯的保護作用，可以抑制細胞凋亡，擴張血管等，其作用機制可涉及多個細胞信號傳導通路[9]。丹參提取物具有抗血小板凝聚、降低血液黏度、調節凝血系統的功能，是一種安全可靠的治療心臟血管疾病的天然中藥[10]。黃芪注射液有調節機體免疫狀態的功能,常用于治療心力衰竭、心率失常和冠心病。黃芪皂苷可通過抑制心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶增強心肌收縮力,改善心室構型、射血功能和心肌營養,降低心肌耗氧量,并可穩定細胞膜從而減輕心肌細胞的損傷[11]。麥冬多糖具有抗心肌細胞損傷的功效，能促進血管新生，從而發揮抗心肌缺血作用[12-13]，麥冬抗心肌缺血和心肌梗死的作用可能與保護心肌的 SOD 活性、防止心肌細胞脂質過氧化及改善脂肪酸代謝有關[14]。麥冬總皂苷對心肌細胞缺氧再灌注損傷具有保護作用[15]。川芎的有效成分揮發油、酚酸及有機酸、生物堿、三萜類化合物等都可以有效地擴張心腦血管，增加血流量，預防冠脈及主動脈痙攣、鎮靜鎮痛，抑制血小板聚集、肝臟纖維增生、氧自由基釋放，解除平滑肌痙攣等[16]。川芎嗪可以通過抑制NF-κB信號通路，改善由血管緊張素 II(Ang II) 介導的新生小鼠心肌細胞肥大[17]。在大鼠血栓模型實驗中，當歸提取液高劑量 (80 mg/kg) 條件下對血栓的形成有拮抗作用，阿魏酸及多種氨基酸具有抗心律失常、擴張血管、減少細胞凋亡等多種藥理作用[18-20]。綜上，隨著中醫藥現代藥理研究的不斷深入，中藥的臨床應用價值越來越被人們所重視。中醫學認為，氣能生血行血，方中6味藥經合理配伍，通過益氣活血的功效，改善心肌缺血，緩解心肌組織氧化損傷。

本實驗證實，GSG組ET、MPO濃度明顯減少，表明GSG能有效降低心肌ET、MPO濃度，減輕心肌缺血再灌注損傷。GSG組心肌組織NF-κB、Iκκβ蛋白表達明顯降低，表明GSG可能通過調節NF-κB、Iκκβ抑制心肌細胞凋亡。細胞凋亡是MIRI的重要損傷因素，本實驗表明GSG能減輕心肌炎癥反應，降低心肌細胞凋亡，減輕氧化損傷，其機制可能與降低ET、MPO，升高GSH-PX、CAT，抑制NF-κB、Iκκβ蛋白表達有關。