康力康呆靈對SAMP8小鼠學習記憶能力及SOD、MDA的影響*

任汝靜，許瀞予，王 敏，柳辰玥，李曉強，尹 婷，杜成成，洪 坤，譚余慶，趙保勝△

(1. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700； 2. 廣東康力醫藥有限公司 廣州 510627；3. 北京中醫藥大學，北京 100029)

老年性癡呆是大腦皮質功能衰退的一種臨床綜合征，患者主要表現為記憶衰退、行為認知障礙[1]，其中最為常見的類型是阿爾茨海默癥(AD)，記憶障礙是AD病人的特征表現之一[2]。而尋找老年性癡呆明確的發病機制和有效的治療手段，是目前生物醫學界的一大研究熱點。本研究就康力康呆靈改善老年性癡呆模型小鼠學習記憶能力，并對其治療老年性癡呆進行初步研究。

1 材料

1.1 實驗動物

早老型癡呆模型SAMP8雄性小鼠60只，體質量28～35 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司(動物生產許可證SCXK(京)2014-0004)。ICR雄性小鼠10只，體質量28～32 g，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司(動物生產許可證SCXK(京)2016-0002)。

1.2 藥品與試劑

康力康呆靈，汕頭市壹杯通有限公司生產(生產許可證號QS440514010484)，將微粉加純凈水經高剪切乳化機攪拌成均勻懸液4 ℃保存備用。鹽酸多奈哌齊片(安理申)，中國衛材藥業有限公司制造(批號1601044)；氯化鈉注射液(生理鹽水)，石家莊四藥有限公司生產(批號1508103203)；無水乙醇，北京化工廠生產(批號160318)；SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20161216)；MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所(批號20161216)。

1.3 儀器

鼠博士Morris水迷宮，上海移數信息科技有限公司生產；鼠博士跳臺儀及視頻分析系統，上海移數信息科技有限公司生產(版本V2.8.7)；FLUO star Omega全自動多功能酶標儀，德國BMG LABTECH公司生產；SIGMA 1-15PK臺式高速離心機，德國sigma公司生產；電子體溫計，鄭州豪潤奇電子科技有限公司生產(專利號2009301940847)。

2 方法[3]

2.1 分組及給藥方法

SAMP8小鼠按體質量隨機分為模型組、康力康呆靈低劑量組(500 mg/kg)、中劑量組(1000 mg/kg)、高劑量組(2000 mg/kg)和陽性對照組(安理申55 mg/kg)各12只。10只ICR小鼠為正常對照組。

各實驗組小鼠均于每天上午8～10 時灌胃給藥，共灌胃4周?？盗荡綮`組及陽性安理申組分別給予不同藥物，空白對照組每天同時給予等量純水灌胃，灌胃量0.2 ml/10 g。

2.2 實驗方法

2.2.1 康力康呆靈對小鼠水迷宮實驗學習記憶能力的影響 水迷宮直徑120 cm，高30 cm，內充自來水，水溫保持(23±2)℃。逃生平臺直徑14 cm，高29 cm，置于宮體內坐標位置的第三象限，低于水面0.7 cm。水迷宮試驗連續6 d，前4 d為訓練時間。第5天將小鼠從同一位置放入水中，記錄小鼠的上臺潛伏期，上臺潛伏期超過60 s的記為60 s。計算出各組上臺百分比(即上臺動物數與動物總數之比)。第6天取出隱蔽平臺，將小鼠從同一位置放入水中60 s，記錄小鼠60 s內穿越平臺次數。

2.2.2 康力康呆靈對小鼠跳臺實驗學習記憶能力的影響 動物放置實驗儀內，適應環境3 min，通交流電流0.25 mA，記錄每只小鼠從受到電擊到跳上跳臺的時間(逃避時間)和5 min內從跳臺跳下的錯誤次數，以此作為學習成績。24 h后將鼠放在跳臺上，記錄第1次跳下的時間(錯誤潛伏期)和3 min內的錯誤次數，以此反映記憶保持情況。

2.2.3 康力康呆靈對小鼠避暗實驗學習記憶能力的影響 實驗裝置明暗兩室之間有一直徑3 cm的圓洞，暗室底部銅柵通電。訓練前先將小鼠放入反應箱中適應5 min，然后暗室底部通以0.25 mA交流電，將小鼠背對洞口放入明室，每只小鼠訓練5 min。記憶測試時將小鼠再次放入明室，記錄小鼠第1次進入暗室的避暗潛伏期，并記錄5 min內進入暗室的錯誤次數。

2.2.4 康力康呆靈對SAMP8小鼠SOD和MDA含量的影響 末次給藥后24 h，小鼠摘眼球取血并取小鼠腦組織，按照SOD、MDA測試試劑盒說明書測定血清與腦內SOD、MDA含量。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 康力康呆靈對小鼠水迷宮實驗學習記憶能力的影響

表1圖1～2顯示，給藥4周后，模型組小鼠上臺潛伏期明顯延長，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，康力康呆靈各劑量組上臺潛伏期均有所降低，低劑量組降低明顯(P<0.05)；康力康呆靈低劑量組上臺百分率較模型組明顯升高(P<0.05)；游泳軌跡結果顯示，康力康呆靈各劑量組小鼠的游泳軌跡均短于模型組小鼠，軌跡路線流暢，方向性明確，其中低劑量組最為明顯。撤掉平臺后，與模型組小鼠比較差異有統計學意義(P<0.05)，康力康呆靈低劑量組增加明顯(P<0.05)。游泳軌跡顯示，康力康呆靈各劑量組小鼠穿越平臺區域的軌跡和平臺所在象限的游泳軌跡均長于模型組，其中低劑量組最為明顯。

表1 康力康呆靈對SAMP8小鼠隱藏平臺實驗學習記憶能力比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05; 與模型組比較:▲P<0.05

3.2 康力康呆靈對小鼠跳臺實驗學習記憶能力的影響

給藥4周后，在學習階段與正常對照組比較，模型組小鼠上臺潛伏期明顯延長(P<0.01)。與模型組比較，康力康呆靈各劑量組上臺潛伏期均有所降低(P<0.01)，錯誤次數顯示，康力康呆靈低劑量組降低明顯(P<0.05)。

表2顯示，在記憶階段與模型組比較，康力康呆靈低、中劑量組與陽性藥安理申組逃避潛伏期有增長趨勢，差異無統計學意義。康力康呆靈中、低劑量組與陽性藥安理申組的錯誤次數有降低趨勢，但差異無統計學意義。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.康利康呆靈低劑量組；E.利康呆靈中劑量組；F.康利康呆靈高劑量組圖1 小鼠隱蔽平臺實驗游泳軌跡比較

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性組；D.康利康呆靈低劑量組；E.利康呆靈中劑量組；F.康利康呆靈高劑量組圖2 小鼠空間探索實驗游泳軌跡比較

組 別鼠數劑量/(mg/kg)學習階段記憶階段潛伏期/s錯誤次數/次錯誤潛伏期/s錯誤次數/次正常組10—2.90±1.520.50±0.71242.40±100.810.40±0.71模型組12—13.27±9.27**2.18±1.17**186.73±115.471.18±1.17陽性藥組12553.50±1.93▲▲0.58±0.51▲▲235.50±85.510.50±0.67低劑量組105002.81±1.33▲▲0.88±0.83▲191.00±105.170.75±0.71中劑量組810001.42±1.28▲▲1.17±1.17218.33±112.770.83±0.98高劑量組1020004.50±1.58▲▲1.90±1.37141.10±93.831.30±0.67

注：與正常對照組比較:**P<0.01; 與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 康力康呆靈對小鼠避暗實驗學習記憶能力的影響

給藥4周后，學習階段錯誤次數與模型組比較，康力康呆靈低劑量組小鼠錯誤次數下降明顯(P<0.05)。表3顯示，康力康呆各劑量組與模型組比較差異無統計學意義。

3.4 康力康呆靈對SAMP8小鼠SOD和MDA含量的影響

表4顯示，末次給藥取材測試后，與模型組比較康力康呆靈各劑量組小鼠血清中SOD活力含量有增長趨勢，但差異無統計學意義；康力康呆靈中劑量組小鼠腦組織中SOD活力含量增長較為明顯(P<0.01)，低劑量和高劑量組與模型組比較有增長趨勢，差異無統計學意義。

表3 康力康呆靈對SAMP8小鼠避暗實驗學習記憶能力比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05; 與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

表4 小鼠血清和腦組織中總SOD、MDA含量比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05；與模型組比較:▲P<0.05

與模型組比較，康力康呆靈各劑量組小鼠血清中MDA含量有所降低(P<0.01)；康力康呆靈低劑量組小鼠腦組織中MDA含量明顯降低(P<0.01)。

關于康力康呆靈各劑量組實驗末期動物減少的說明，在康力康呆靈改善學習記憶藥效學研究中，康力康呆靈各劑量組小鼠在給藥期間出現一定的皮損現象，且呈現一定的量-毒與時-毒關系，根據小鼠皮損現象出現的時間及給藥時長分析，初步推斷該現象與康力康呆靈給藥周期時長有關。

4 討論

隨著世界人口老齡化的加劇，老年性癡呆的發病概率也隨之上升，預計到2040年全球癡呆人數將達到8110萬，中國將達到2200萬，預計到2050年這一數字將上升到1.5億[4-5]。已知多種因素可造成老年性癡呆，其中人口學因素、行為因素、疾病因素為主。近年來的研究指出，社會心理因素也是誘發老年性癡呆的一個主要因素[6]。目前的研究認為，老年性癡呆發病機制復雜，衰老自由基學說已得到公認[7-8]，自由基引起的過年化損傷是老年性癡呆等疾病發病的一個重要原因。MDA是脂質過氧化產物，可直接損傷生物大分子及細胞膜[9]，SOD是機體清除自由基的重要酶類，兩者直接參與體內氧自由基代謝[10]。腦老化過程中，神經細胞膜不飽和脂肪酸被氧化產生大量自由基，損傷細胞膜、細胞器，產生炎癥反應，最終引起細胞凋亡、退行性病變、學習記憶能力下降[11-12]，最終導致老年性癡呆等眾多老年病的發生。因此抑制氧自由基生成，提供抗氧化功能及增加SOD等抗氧化酶類含量，成為目前研究的重點[14]。目前老年性癡呆的藥物治療首選是AchE抑制劑，同時根據具體情況聯合其他藥物使用以期達到保護腦神經、恢復腦功能的治療效果，亦可聯合抗精神藥物治療行為癥狀和心理癥狀[1]。

康力康呆靈是由廣東康力醫藥有限公司開發的一款旨在改善神經系統功能的保健產品，以茶為載體，以兔耳草為君藥，添加何首烏等中藥提取物，對抑郁癥、老年癡呆具有一定的改善作用。本實驗選用SAMP8早老性癡呆模型小鼠探究康力康呆靈對改善老年性癡呆引起的學習記憶能力下降和其簡單機制的研究。實驗結果表明，康力康呆靈不同劑量對小鼠的學習記憶力均有一定的改善作用，其中低劑量作用最明顯，康力康呆靈中、高劑量在提高學習能力方面作用較為顯著，在增強記憶能力方面作用不顯著。康力康呆靈各劑量藥物可以在一定程度上改善小鼠氧化水平，降低氧化應激損傷，其中低劑量作用最明顯。在研究中發現，康力康呆靈有效減少大鼠腦組織MDA含量的增加，而同時能夠提高大鼠腦組織的SOD活性。這些數據表明，康力康呆靈對AD大鼠腦組織氧自由基的清除具有明顯的改善作用，對老年性癡呆的防治具有一定作用。氧自由基在腦組織和血清中含量不同，但經過藥物干預后顯示出對腦組織和血清不同的作用趨勢，在提高SOD含量方面，康力康呆靈可能在腦內發揮更強作用，而在血清中顯示出更強的清除MDA能力。因此，通過本實驗結果認為，康力康呆靈可能是通過影響模型小鼠氧化應激途徑，減少MDA的產生，從而降低其對生物大分子及細胞膜的損傷作用。另一方面，康力康呆靈可提高SOD含量，使得氧自由基代謝加快，迅速減少由脂質過氧化產生的MDA等有害物質，減少對大腦的損害，達到改善老年癡呆的目的。大量臨床案例和動物實驗證實了中藥治療老年性癡呆的有效性。在中醫理論指導下經過合理組方，中藥對治療老年性癡呆有很大潛力。