肝郁證元素在建立多囊卵巢大鼠模型中的干預(yù)作用*

牛艷艷，賈力莉，宋美卿，馮瑪莉，楊 鈐

(山西省中醫(yī)藥研究院，太原 030012)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是婦科內(nèi)分泌疾病中最為常見的一種疾病，是一種生殖功能障礙與代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合征[1]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，該病多起病于圍初潮期，從青春期開始發(fā)病至20～30歲呈現(xiàn)發(fā)病高峰，約占總數(shù)的85.3%。青春期PCOS患者代謝紊亂，尤其是脂質(zhì)代謝紊亂，發(fā)生率高達(dá) 48.3%，是動(dòng)脈硬化癥和冠心病的高危人群，早期對(duì)其生活方式調(diào)整和代謝紊亂的糾正，能預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)青春期PCOS，為早期阻斷和糾正其內(nèi)分泌紊亂奠定基礎(chǔ)[2]。近10年，PCOS治療范圍的擴(kuò)大，不僅限于對(duì)高雄激素和月經(jīng)紊亂的治療，而且通過糾正血脂異常，預(yù)防發(fā)生遠(yuǎn)期心血管疾病，并成為治療 PCOS 的遠(yuǎn)期目標(biāo)之一。更有學(xué)者提出，與PCOS相關(guān)的心血管疾病危險(xiǎn)因素即胰島素抵抗、高血壓和血脂異常，應(yīng)納入PCOS的日常健康治療方案中[3]。

大鼠PCOS模型制備多停留在激素給藥的階段，旨在模擬人類PCOS病理特征和激素改變，檢測(cè)指標(biāo)多為影響生殖的激素類指標(biāo)，但尚未見關(guān)注情志在青春期PCOS致病中的作用，與之相關(guān)聯(lián)的PCOS的代謝指標(biāo)也少有研究。根據(jù)中醫(yī)對(duì)PCOS的辨證分型以肝郁證最多，結(jié)合中醫(yī)“肝郁”對(duì)青春期多囊卵巢綜合征的臨床研究資料，本研究選擇更接近臨床表現(xiàn)的肝郁型青春期多囊卵巢綜合征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激反應(yīng)[4]和雄激素致多囊卵巢綜合征相結(jié)合的方法，通過檢測(cè)本模型中脂質(zhì)代謝指標(biāo)的相應(yīng)變化規(guī)律，探討其對(duì)代謝紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠雌性，24 d齡(許可證號(hào)SCXK(京)2014-0013,合格證號(hào)11400500011999)。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境，溫度22±1 ℃，濕度(50±5)%RH，動(dòng)物自由飲水、攝食，大小鼠維持飼料，中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 甘油三酯測(cè)定試劑盒(TG，GPO-PAP法，批號(hào)157231)、膽固醇測(cè)定試劑盒(TC，CHOD-PAP法，批號(hào)151851)、低密度脂蛋白測(cè)定試劑盒(LDL,直接法-表面活性劑清除法，批號(hào)140451)、高密度脂蛋白測(cè)定試劑盒(HDL，直接法-過氧化氫酶清除法，批號(hào)140481)，以上4種試劑盒均為中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)。脫氫表雄酮(DHEA)，武漢欣欣佳麗生物科技有限公司(批號(hào)20140603)；胰島素(INS)，武漢優(yōu)爾生科技有限公司(Uscn Life Science Inc)；CCA448Ra,Lot:L160323685, Exp:Sept.2016。瘦素(LP)，E0084 r,Lot:6D055c, Exp:Oct.2016；脂聯(lián)素(ADP)，E0605 r；Lot:6D055c； Exp:Oct.2016，以上2種試劑盒均為伊艾博生物科技有限公司生產(chǎn)(WUHAN EIAAB SCIENCE CO.,LTD.)。電子天平(BP310P，德國賽多利斯)；萬能顯微鏡熒光成像系統(tǒng)(BX51+DP72+IPE)；全自動(dòng)生化分析儀(chemray 360)，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司(意大利)；多功能微孔讀板機(jī)(Synergy H1)，美國BioTek；培養(yǎng)箱(LRH-150)，廣東省醫(yī)療器械廠；光熱尾痛儀(SW-200)，成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 取雌性24 d齡大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、肝郁組、雄激素組、肝郁加雄激素組4組各10只，除空白對(duì)照組外其余各組分別造模。肝郁組按照文獻(xiàn)方法[5]采用8種刺激法(禁食禁水24 h，4 ℃冰水游泳2 min，孤養(yǎng)且鼠籠傾斜45°放置24 h,破壞生活環(huán)境,耳部電擊(36.5v),晝夜顛倒,烘箱(45 ℃)烘烤5 min)，每天1種，且相鄰2 d不得重復(fù)同一種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生；雄激素組將脫氫表雄酮(DHEA)溶于80%甘油中，大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，每只每日注射0.2ml[6]；肝郁加雄激素組同時(shí)進(jìn)行肝郁法和雄激素法造模，各組動(dòng)物造模時(shí)間均為21 d。

1.2.2 指標(biāo)觀察 動(dòng)物動(dòng)情周期的觀察:造模結(jié)束后，各組連續(xù)4 d同一時(shí)間進(jìn)行陰道涂片，并行巴氏染色觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)大鼠動(dòng)情周期變化；殺檢取材及指標(biāo)觀察:造模結(jié)束后，各組大鼠殺檢后取雙側(cè)卵巢10%甲醛固定，石蠟包埋常規(guī)切片，HE染色鏡檢觀察卵巢組織病理變化；檢測(cè)指標(biāo):造模結(jié)束后，禁食12 h后各組大鼠10%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血放置2000 r/min離心分離血清。自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL),化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胰島素(FINS),酶聯(lián)免疫法檢測(cè)瘦素(LEP)和脂聯(lián)素(ADP)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模情況觀察結(jié)果

2.1.1 動(dòng)物動(dòng)情周期的觀察 圖1顯示，成熟大鼠有較穩(wěn)定的動(dòng)情周期，持續(xù)時(shí)間4～5 d。造模21 d結(jié)束后陰道涂片結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠陰道涂片可見有規(guī)律的動(dòng)情周期，造模組大鼠陰道涂片則均持續(xù)出現(xiàn)大量角化無核的上皮細(xì)胞。3個(gè)造模組比較，肝郁組出現(xiàn)不規(guī)則動(dòng)情周期的比例小于其余2組造模組。

圖1 各組陰道涂片觀察比較

2.1.2 動(dòng)物組織病理學(xué)觀察 圖2顯示，鏡下空白對(duì)照組見多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、卵泡膜細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層，卵細(xì)胞各層次解剖結(jié)構(gòu)清晰；肝郁組鏡下可觀察到有的動(dòng)物出現(xiàn)較多閉鎖卵泡，有些則未出現(xiàn)；雄激素組和肝郁聯(lián)合雄激素組全部出現(xiàn)較多空泡，卵母細(xì)胞或放射冠消失，黃體數(shù)目明顯減少。

2.1.3 造模結(jié)束后各組動(dòng)物檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果 (1)對(duì)各組動(dòng)物血脂的影響：表1顯示，全自動(dòng)分光光度法檢測(cè)大鼠造模完成后肝郁組、雄激素組和肝郁加雄激素組與空白對(duì)照組比較，甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)均有升高趨勢(shì)，其中雄激素組和肝郁加雄激素組甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)與空白對(duì)照組比較有顯著升高 (P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與雄激素組比較，甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)有顯著升高 (P<0.05)。(2)對(duì)胰島素、脂聯(lián)素和瘦素的影響：表2顯示，化學(xué)發(fā)光免疫吸附法測(cè)定模型各組與空白對(duì)照組比較胰島素(INS)有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)與空白對(duì)照組比較，激素組和肝郁加激素組瘦素(LP)明顯升高(P<0.05)，肝郁加激素組脂聯(lián)素(ADP)明顯降低(P<0.001)；與激素組比較，肝郁加激素組顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組HE染色病理結(jié)果比較

3 討論

中醫(yī)臨床對(duì)多囊卵巢綜合征辨證多從脾腎著手，病因病機(jī)也多因脾腎陽虛、痰濕凝聚所致。從中醫(yī)肝對(duì)生殖系統(tǒng)影響來看,《素問病機(jī)氣宜保命集·婦人胎產(chǎn)論》曰：“婦人天癸既行，皆從厥陰論之。”葉天士《臨證指南醫(yī)案》云：“女子以肝為先天。”婦人經(jīng)帶胎孕發(fā)端于天癸，憑借于沖任，植根于胞宮皆賴肝血旺盛。肝氣疏暢則任通沖盛，月經(jīng)以時(shí)下，胎孕乃成。肝之疏泄失司易致肝郁氣滯，氣滯則血滯成瘀，瘀阻胞脈胞絡(luò)，卵子無法正常排出。肝之藏血失司，陰血下注胞宮失去正常月節(jié)律，月經(jīng)潮止無常，經(jīng)血不調(diào)，變生他證，日久甚則發(fā)為癓瘕積聚，最終形成多囊卵巢。“從肝論治”多囊卵巢綜合征取得的療效，亦佐證了肝在多囊卵巢綜合征辨證中不可動(dòng)搖的地位[7]。中醫(yī)對(duì)PCOS的辨證分型以肝郁證、痰濕證所占比例最大，分別為37.5%、36.4%，其次是腎虛證、血瘀證較少，說明肝郁是PCOS的重要病機(jī)之一[8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究提示，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激反應(yīng)(CUS)是指當(dāng)機(jī)體感受應(yīng)激源時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)興奮性提高，腎上腺分泌應(yīng)激激素糖皮質(zhì)類固醇升高，從而動(dòng)員儲(chǔ)能適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，有利于機(jī)體度過短期惡劣環(huán)境。但若機(jī)體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，將嚴(yán)重影響人體的身心健康，使機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥狀。應(yīng)激模型能較真實(shí)地模擬抑郁病人的某些病因和癥狀，故可用于抑郁癥的病理生理機(jī)制，是目前應(yīng)用和研究較多的郁證模型。

表1 對(duì)血脂的影響

注：與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與雄激素組比較：4)P<0.05

表2 對(duì)胰島素、瘦素、脂聯(lián)素的影響比較

注：與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，3)P<0.001；與雄激素組比較：4)P<0.05

動(dòng)物陰道涂片結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠陰道涂片可見有規(guī)律的動(dòng)情周期，造模組大鼠陰道涂片則均持續(xù)出現(xiàn)大量角化無核的上皮細(xì)胞。此外病理結(jié)果顯示，空白對(duì)照組見多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、卵泡膜細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層，卵細(xì)胞各層次解剖結(jié)構(gòu)清晰，造模組出現(xiàn)較多空泡，卵母細(xì)胞或放射冠消失，黃體數(shù)目明顯減少，以上結(jié)果均提示造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純連續(xù)使用“肝郁”刺激，使雌性大鼠的動(dòng)情周期發(fā)生明顯變化，病理結(jié)果提示出現(xiàn)了一定程度的病理組織形態(tài)學(xué)改變，其對(duì)脂質(zhì)代謝的影響逐漸顯現(xiàn)，但這些變化呈現(xiàn)出一定的趨勢(shì)性，并未全部出現(xiàn)。由于“肝郁”因素的加入，肝郁聯(lián)合雄激素組大鼠的TG、TC、HDL、LDL檢測(cè)指標(biāo)均有升高趨勢(shì)，且使LDL和TG值攀升幅度加大，提示“肝郁”對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)均有較大的潛在危害；瘦素和脂聯(lián)素都是脂肪細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)[9]，是機(jī)體脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控因子，“肝郁”對(duì)瘦素和脂聯(lián)素均有顯著影響，以對(duì)脂聯(lián)素的影響更為明顯。有報(bào)道稱，血漿脂聯(lián)素水平與甘油三脂和低密度脂蛋白成負(fù)相關(guān)關(guān)系，在本實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)。提示“肝郁”因素使大鼠脂質(zhì)代謝紊亂程度進(jìn)一步加深。另外，瘦素和脂聯(lián)素對(duì)胰島素有增敏作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，胰島素的變化雖然還不甚明顯，但推測(cè)隨著脂質(zhì)代謝紊亂程度的積累，其遠(yuǎn)期效應(yīng)會(huì)大大增強(qiáng)2型糖尿病、心功能低下及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率，還需作進(jìn)一步的研究探討。綜上所述，肝郁對(duì)青春期大鼠生理功能的影響不可小覷。提示青春期多囊卵巢綜合癥這個(gè)群體，在臨床辨證施治時(shí)，因其在現(xiàn)代社會(huì)中的眾多角色，導(dǎo)致其心理負(fù)荷過重、心理壓力過大等情志變化，會(huì)直接影響到各項(xiàng)生理指標(biāo)和臨床癥狀，這就是為什么臨床治療時(shí)加入疏肝思路常常收到意想不到的療效，因此多關(guān)注青春期多囊卵巢綜合癥女性情志的變化，重視早期診斷，因勢(shì)利導(dǎo)，切斷疾病可能發(fā)生潛在的諸多病因，遏制其代謝的“聯(lián)動(dòng)效應(yīng)”，真正貫穿中醫(yī)“整體觀念、辨證論治”的理論思想，是臨床治療青春期多囊卵巢綜合癥疾病時(shí)需要加入的新思路。