肝郁脾虛胰島素抵抗肥胖大鼠模型的建立與評價*

張 旭，周 珊，陳慧臻，高 陽，朱宇溪，陳 秋

(成都中醫藥大學臨床醫學院，成都 610072)

肝郁脾虛證又稱肝脾不和證，是中醫常見的臟腑病證之一，其形成多與現代抑郁、焦慮、悲痛等負面情緒心理應激狀態有關[1]。肝主疏泄，調暢氣機，協助脾胃升降并輸送膽汁于腸道，促進脾胃對飲食物的運化、輸布。肝病則疏泄失職，中焦氣機阻滯，升降失司，脾氣不升則清氣在下生飧泄，出現腸鳴、腹瀉等癥狀，胃氣不降則濁氣在上生嗔脹。中焦氣郁，郁則氣消，脾虛運化失常，氣血生化無源，則出現納差、消瘦等癥狀；患病日久痰濕內生，郁而化熱，致脾弱胃強。胃火熾盛，納食亢進，負荷加重，然脾虛運化無力又生痰濕致人肥胖。但是目前國內建立的肝郁脾虛證模型普遍存在造模時間短，只考察短期內肝郁脾虛引起的體質量下降，而未對長時間肝郁脾虛引起的食欲亢進、肥胖和代謝紊亂進行評估[2-3]。因此本實驗模擬現代人情志不遂致病的病因病機，在以往研究的基礎上延長了肝郁脾虛證造模的時間，建立了長時間的肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型，并從體質量、血糖、血脂水平、內臟指數、激素水平和胰島素抵抗等方面進行了綜合考察和評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雌性大鼠，體質量280～320 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供(批號SCXK2015-030)，自由攝食進水，室溫18～25 ℃。

1.2 實驗儀器

ISP-21半自動生化分析儀(荷蘭)；BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)；TGL-16G臺式離心機(上海安亭儀器廠)；高速低溫離心機(德國HERAEUS)；SN-682放射免疫γ計數器(中國科學院上海原子核研究所日環儀器廠)；八臂迷宮測試系統(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 試劑

血糖檢測試劑盒(批號分別為1704121、1705031、1705041)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒(批號1705041)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(批號1705031)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(批號1705031)均為四川邁克科技責任有限公司產品；125I-胰島素、125I-胰高血糖素、125I-皮質酮放射免疫分析試劑盒為北京市北方生物技術研究所產品(批號20170620)，其他試劑均為分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模篩選實驗方法 將40只雌性Wistar大鼠分為正常對照組、慢性束縛組、夾尾組和慢性束縛+夾尾組各10只。慢性束縛法造模[2]：即將大鼠放入自制的有機玻璃制成的圓筒狀結構，令其身軀和四肢不能自由活動，每日連續束縛3 h(8∶00-11∶00am)；夾尾法造模[4]：每日用塑料夾夾尾1 h(3∶00-4∶00 pm)，以刺激大鼠使其感覺不適，從而嘗試轉頭咬掉塑料夾，但轉頭咬掉塑料夾的努力往往徒勞無功，如若塑料夾被咬掉立即重新夾上，這樣不僅可以讓每只大鼠受到的刺激基本相同，刺激時間較長并持續不斷，又讓其郁怒不已，更好地收到“怒傷肝，久則郁”的效果；慢性束縛加夾尾法造模：每日連續束縛3 h(8∶00-11∶00am)，當日下午再將大鼠用塑料夾夾尾1 h(3∶00-4∶00 pm)。連續造模8周，期間正常飲食，每2周測量攝食量、體質量，并于第8周(實驗第56天)對其肝郁脾虛一般情況和行為學進行評估。

1.4.2 長期肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型評價方法 將20只雌性Wistar大鼠分為正常對照組和模型組各10只。模型組按照上述篩選成功的造模方法即慢性束縛+夾尾法進行，造模時間連續8周。造模期間正常飲食，每隔2周連續測量體質量并在眼球后靜脈叢采血測血糖、血脂。并于第8周(實驗第56天)8∶00 pm開始各組大鼠禁食，次日8∶00am進行胰島素鉗夾實驗。實驗結束時處死所有大鼠并收集血液，0.1 mol/L EDTA抗凝，立即離心并分離血漿用于測定或保存于-20 ℃。同時取肝臟、腎臟、脾臟、胸腺測內臟指數(內臟指數=內臟重/體質量×1000)。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況觀察 肝郁脾虛證采用動物外觀及行為積分量表[3]的形式作為判斷一般情況的標準，包括活動狀態、皮膚毛發變化、對外界刺激的反應、大便性狀、掙扎時的表現、精神狀態，根據上述表現明顯記3分，介于明顯與輕微間記2分，輕微記1分，沒有記0分。

1.5.2 行為學指標測試 用高架十字迷宮實驗[5]測試大鼠開放臂進入次數比(OE%)、開放臂停留時間比(OT%)以及開放臂和封閉臂總的進入次數(OE+CE)。同時，用強迫游泳實驗[6]記錄大鼠在5 min內靜止的時間。

1.5.3 血糖、血脂的測定 具體操作參見試劑盒說明書，結果以mmol/L表示。

1.5.4 血漿激素含量測定 用放射免疫法進行測定，具體操作參見試劑盒說明書。檢測結果胰島素以μIU/mL表示，胰高血糖素以pg/mL表示，皮質酮以μg/mL表示。

1.5.5 胰島素抵抗的判定 用高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗[7-8]評價胰島素敏感性。這一技術由De Fronoz于1979年創立，是目前世界公認的評價胰島素抵抗的金標準。鉗夾實驗結束后采血常規制備血清，處死動物迅速取出肝臟、腎臟、脾臟、胸腺并稱重。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 長期肝郁脾虛肥胖大鼠模型方法篩選

2.1.1 各組大鼠一般情況和行為學指標的變化 表1顯示，與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠一般情況評分在第8周時均顯著下降(P<0.01)，大鼠既表現有情緒焦慮或精神抑郁等肝郁之象，也表現出大便溏薄、活動遲滯等脾虛之象，說明3組大鼠肝郁脾虛癥狀都非常明顯，但組間比較差異無統計學意義。另外與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠開放臂進入次數比(OE%)、開放臂停留時間比(OT%)以及開放臂和封閉臂總的進入次數(OE+CE)均顯著下降，同時3組大鼠強迫游泳實驗5 min內的靜止時間也顯著高于正常對照組。

表1 各組大鼠一般情況和行為學指標變化比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.1.2 各組大鼠日均攝食量的變化 表2顯示，與正常對照組比較，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠在第2周、第4周攝食量均減少，但在4周后3組大鼠的攝食量均有回升趨勢，尤其是束縛+夾尾組大鼠在第6周和第8周的攝食量與正常對照組比較顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠日均攝食量變化比較(g)

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.1.3 各組大鼠體質量變化 表3顯示，束縛組、夾尾組和束縛+夾尾組大鼠在前4周內體質量均下降，在第4周時與正常對照組比較差異有統計學意義。在4周后，3組大鼠體質量有回升趨勢，但在第6周時與正常對照組比較無明顯差異。而束縛+夾尾組大鼠6周后體質量持續增長，在第8周時與正常對照組比較顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠體質量變化比較(g)

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 長期肝郁脾虛致大鼠肥胖和胰島素抵抗模型方法評價

2.2.1 2組大鼠體質量、血糖和血脂變化 表4顯示，模型組大鼠體質量在前4周內出現明顯下降，在第4周時與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；在4周后體質量逐漸增加，第6周時與正常對照組比較差異無統計學意義，第8周體質量超過正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，模型組大鼠的血糖和總膽固醇(TC)在4周后有增高趨勢，但與正常對照組比較差異無統計學意義。另外， 模型組大鼠的甘油三酯(TG)在4周后明顯增加，而高密度脂蛋白(HDL)則明顯降低，在第6周和第8周時與正常對照組比較差異有統計學意義。

表4 2組大鼠體質量、血糖和血脂變化比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 2組大鼠內臟指數、血漿激素和葡萄糖輸注率的變化 表5顯示，模型組大鼠的肝臟指數和腎臟指數增加，而脾臟指數和胸腺指數降低，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。另外模型組大鼠的血漿胰島素、胰高血糖素和皮質酮水平均增加，其中胰島素和皮質酮含量與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；同時模型組大鼠的葡萄糖輸注率下降，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表5 2組大鼠內臟指數、血漿激素和葡萄糖輸注率變化比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肝郁脾虛證的基本病機為肝失疏泄，脾失健運，主要表現為精神抑郁、情緒不寧、胸脅脹悶或易怒善哭、脘悶噯氣、不思飲食、大便不調為特征的一類臨床病證。如唐容川《血證論》所云：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化。設肝之清陽不升，則不能疏泄水谷，滲泄中滿之證，在所不免?！睆默F代醫學觀點來看，長時間的焦慮、抑郁會引發神經、內分泌、免疫等多系統功能的改變，進而導致肥胖和代謝紊亂[9]。我們第一步的工作就是篩選出長時間肝郁脾虛致大鼠肥胖模型的方法，然后再對篩選出的模型進行全面評價。

從初篩實驗中我們采用的3種方法來看，無論是慢性束縛組、夾尾組還是慢性束縛加夾尾組，3組大鼠在連續造模8周后其肝郁脾虛癥狀均較明顯，并在前4周內3組大鼠的攝食量和體質量均出現明顯的下降，這與文獻的報道較一致[2-3]。但慢性束縛加夾尾組大鼠的攝食量和體質量在4周后持續增加，增加幅度大于單純束縛和單純夾尾組。故根據對上述實驗結果分析我們認為，初篩的3種方法中，慢性束縛加夾尾法是建立長期肝郁脾虛致肥胖大鼠模型的較佳方法。

采用慢性束縛加夾尾的方法進一步重復8周的實驗結果看，該方法造模的大鼠在實驗后期體質量的增長依然保持穩定，甘油三酯(TG)顯著增高，高密度脂蛋白(HDL)顯著下降。除此之外，肝臟指數、腎臟指數和血漿皮質酮水平在第8周時也顯著增高。皮質酮是腎上腺皮質分泌的主要激素，在慢性應激狀態下升高的皮質酮具有升高血糖、降低胰島素敏感性、促進脂肪動員和導致向心性肥胖的作用[10]。在這種情況下，機體對糖的利用減少，而脂肪的分解代謝增強，產生大量的游離脂肪酸(FFA)釋放入血，并進入其他組織重新合成脂肪導致脂質異位沉積。而進入肝臟的FFA增多可使TG和VLDL增加，加重血脂異常并導致肝臟脂肪變性和質量增加，出現中心性肥胖[11]。同時這些過度堆積的脂肪又是機體出現胰島素抵抗的主要原因，其機制主要與脂肪細胞來源的激素，如瘦素、抵抗素的增多以及脂聯素的降低有關，這些激素分泌的變化不但影響脂肪的存儲與釋放，還會降低靶組織對胰島素的敏感性[12]。因此，脂肪過度沉積與肥胖往往與胰島素抵抗互為因果。為克服胰島素抵抗，機體往往代償性地分泌過多胰島素引起高胰島素血癥，后者可能進一步加重組織的胰島素抵抗程度[11]。臨床可通過高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗檢測靶組織對胰島素的敏感性。我們通過這一實驗也發現，模型組大鼠在肥胖、肝臟增大的同時也出現了一定程度的胰島素抵抗。

另外，情緒刺激可通過神經-內分泌-免疫網絡(NIM)引起免疫功能異常。肝郁脾虛證是中醫肝郁和脾虛的復合證，也涉及到神經、內分泌、免疫等多系統功能的改變，提示肝郁脾虛證的現代內涵與免疫功能異常有關[13]。而胸腺和脾臟分別是體內中樞和外周的主要免疫器官，在維持機體正常免疫功能方面發揮著重要的作用。本次實驗觀察到，慢性束縛加夾尾法導致肝郁脾虛大鼠胸腺和脾臟指數均呈現顯著下降，且皮質酮在后期也明顯升高。皮質酮不僅可以提高機體的應激能力，而且還有降低免疫力的作用[10]。因此，大鼠在束縛加夾尾導致肝郁脾虛的同時脾臟和胸腺指數均下降，其中一個原因是與長期慢性應激導致的腎上腺皮質功能亢進有關。

總之，我們用長時間慢性束縛加夾尾法成功誘導肝郁脾虛大鼠肥胖和胰島素抵抗模型。該模型具有成模后肝郁脾虛證癥狀較明顯，體質量在早期短時間內降低后出現增高且維持穩定，血脂代謝和激素異常也與大多人類肥胖癥相似，同時兼有免疫抑制現象等優點，且該造模方法簡單易操作，有利于后續藥理學實驗進行。