多重熒光定量PCR方法在呼吸道合胞病毒和腺病毒檢測中的Meta分析

趙莉 李貴霞 趙民 王佶 張瑞卿 馮志山 馬學軍

050031石家莊,河北醫(yī)科大學(趙莉、張瑞卿);050031石家莊,河北省兒童醫(yī)院(李貴霞、馮志山);053500景縣,河北省景縣人民醫(yī)院(趙民);102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病所(王佶、張瑞卿、馬學軍)

呼吸道感染是一類常見的疾病，80%以上病例由病毒引起，它在嬰幼兒、兒童、老年人、免疫力低下的人群中有極高的發(fā)病率和死亡率[1-3]。引起呼吸道感染的常見病毒主要有呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、腺病毒(adenovirus，ADV)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)、人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)、流感病毒(influenza virus，IFV)[1，4]，其中 RSV 和 ADV 分別是呼吸道RNA病毒和DNA病毒中較常見的病毒[5]。

近些年來，分子生物學檢測技術不斷發(fā)展，其中實時熒光定量PCR(qRT-PCR)具有高靈敏度、高特異性且操作簡便等優(yōu)點[6]，多重實時熒光定量PCR(multiplex real time polymerase chain reaction，MRTPCR)技術能夠實現(xiàn)高通量檢測，在qRT-PCR優(yōu)點的基礎上又節(jié)省了成本、減少了工作量[7]。為科學評價MRT-PCR方法檢測呼吸道病毒的價值，為臨床應用提供參考，本研究對MRT-PCR檢測呼吸道感染中常見的RNA病毒(RSV)和DNA病毒(ADV)進行了Meta分析。

1 材料與方法

1.1 文獻納入標準和排除標準 文獻的納入標準:(1)研究類型為診斷性研究。(2)研究目的為評價MRT-PCR方法對呼吸道病毒的診斷價值。(3)中文和英文文獻。(4)文獻能直接或間接提供原始數(shù)據(jù)獲得四表格數(shù)據(jù):真陽性值(true positive，TP)、假陽性值(false positive，F(xiàn)P)、假陰性值(false negative，F(xiàn)N)、 真陰性值(true negative，TN)。 排除標準:(1)重復發(fā)表的文章。(2)無全文的文章。(3)用MRT-PCR方法作為唯一的參考標準去評估其它的MRT-PCR的文章。(4)研究例數(shù)＜30例。(5)重要數(shù)據(jù)報告缺失。除此之外，我們排除學位論文、文摘、綜述、講座和述評類文獻。

1.2 檢索策略 計算機檢索美國國立醫(yī)學圖書館PubMed數(shù)據(jù)庫、荷蘭醫(yī)學文摘 EMBASE數(shù)據(jù)庫、Cochrane臨床試驗數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、CNKI數(shù)字圖書館。檢索時間限定為2010年1月至2018年1月。 英文檢索詞包括:multiplex，real time，quantitative，pcr，polymerase chain reaction，respiratory virus，respiratory tract infection， respiratory infection，respiratory tract disease， respiratory disease， common cold， influenza， pneumonia， bronchitis， bronchiolitis，rhinosinusitis， pharyngitis， laryngitis， otitis media，tonsillitis， asthma， copd， chronic obstructive lung disease。中文檢索詞包括:多重熒光定量PCR，呼吸道病毒。

1.3 文獻篩選、數(shù)據(jù)提取和質量評價 由本研究中的兩名人員分別獨立提取數(shù)據(jù)，如出現(xiàn)意見不一致時，征求第三方專家解決。所有文獻信息錄入Excel數(shù)據(jù)庫，錄入信息包括:作者、發(fā)表年、國家、研究例數(shù)、年齡范圍、呼吸道病毒檢測的參照方法、計算靈敏度、特異度所需的四格表數(shù)據(jù)，納入文獻的檢測限。采用診斷準確性研究的質量評價工具QUADAS-2[8](quality assessment of diagnostic accuracy studies-2)對所納入研究的方法學質量及偏倚風險進行評價，包括病例的選擇、待評價試驗、金標準、病例流程和進展情況4部分。

1.4 統(tǒng)計學方法 本研究采用Meta-Disc1.4軟件進行異質性檢驗和合并統(tǒng)計量分析，使用Stata 12.0軟件進行發(fā)表偏倚檢測。首先采用spearman相關分析檢測有無閾值效應的存在。進而用I2評估所納入原始研究間的異質性。當P＞0.1，I2≤50%(I2反映了研究間變異占總變異的百分比)時采用固定效應模型，否則認為存在異質性，采用隨機效應模型對各診斷指標進行匯總處理。診斷評價指標主要包括:敏感度(sensitivity，sen)、特異度(specificity，spe)、陽性似然比(positive likelihood ratio， +LR)、陰性似然比(negative likelihood ratio，-LR)、診斷優(yōu)勢比(diagnostic odds ratio，DOR)、綜合受試者工作特征(summary receiver operating characteristics，SROC)曲線下面積(area under curve，AUC)和 Q指數(shù)，同時計算相應的95%CI值。發(fā)表偏倚采用Deek檢驗完成。檢驗水準均設為α=0.05。

2 結果

2.1 文獻檢索結果 根據(jù)指定的檢索策略共獲得相關文獻2 113篇，經逐層篩選，按照排除標準排除不符合要求的文獻，最終獲得10篇評估MRT-PCR方法檢測呼吸道合胞病毒和腺病毒感染的診斷價值的文獻，共包括病例2 528例。文獻的篩選流程和結果見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖Fig.1 Flow diagram of the literature search

表1 納入文獻的基本信息Tab.1 Characteristics of 10 included studies

2.2 納入研究的基本特征和偏倚風險評估 納入的10篇文獻中，納入研究的基本特征見表1。本研究采用QUADAS-2工具進行偏移風險評價，結果顯示主要風險來源于病例的選擇部分，待評價實驗、金標準、病例流程和進展情況大部分是低風險偏倚。

2.3 Meta分析結果

2.3.1 異質性檢驗:MRT-PCR檢測RSV閾值效應檢驗結果為:計算靈敏度對數(shù)與 (1-特異度)對數(shù)的spearman相關系數(shù) =0.596(P=0.069)；Meta-Disc1.4軟件擬合的ROC曲線不呈“肩背狀”，提示尚不能認為存在閾值效應。研究間敏感性和特異性的異質性檢驗結果顯示P=0.00，I2=85.1%；P=0.00，I2=90.1%。納入的MRT-PCR檢測RSV的研究結果間存在異質性，且并非閾值效應引起。MRTPCR檢測ADV閾值效應檢驗結果為:spearman相關系數(shù)=0.071(P=0.867)；Meta-Disc1.4軟件擬合的ROC曲線不呈“肩背狀”，提示尚不能認為存在閾值效應。研究間敏感性和特異性的異質性檢驗結果顯示 P=0.00，I2=74.6%；P=0.00，I2=80.3%。 納入的多重熒光定量PCR檢測ADV的研究結果間存在異質性，且并非閾值效應引起。因此多重熒光定量PCR檢測RSV和ADV感染均采用隨機效應模型進行合并統(tǒng)計量分析。

2.3.2 合并效應量結果:隨機效應模型Meta分析結果顯示:MRT-PCR檢測 RSV的 Sen合并，Spe合并，+LR合并，-LR合并分別為0.87(95%CI:0.83-0.90)、0.98(95%CI:0.97-0.98)、64.05(95%CI:18.84-217.68)、0.12(95% CI:0.05-0.26)， 見 圖 2。DOR合并、AUC和 Q指數(shù)分別為919.76(95%CI:432.74-1954.89)、1.00 和 0.97。 MRT-PCR 檢測ADV 的 Sen合并， Spe合并， +LR合并， -LR合并分別為0.64(95%CI:0.56-0.71)、0.99(95% CI:0.98-0.99)、107.16(95%CI:24.28-472.95)、0.19(95%CI:0.07-0.50)，見圖3。 DOR合并、AUC和 Q 指數(shù)分別為 596.29(95% CI:222.77-1596.09)、0.99和0.96。

圖2 MRT-PCR 檢測 RSV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林圖Fig.2 Forest plot of total sensitivity(A)， total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of RSV

2.4 敏感性分析 敏感性分析通過逐一剔除研究例數(shù)較少的幾篇文獻，重新計算各合并統(tǒng)計量。結果顯示，Sen合并、Spe合并、AUC 的改變都非常小，可以認為本研究結果穩(wěn)定性較好。

2.5 發(fā)表偏倚分析 采用Stata12.0軟件繪制Deek漏斗圖，評估納入研究的發(fā)表偏倚。對RSV和ADV進行評估，結果分別為t=-1.12，P=0.30；t=-0.06，P=0.95，P 值均大于 0.05，差異無統(tǒng)計學意義，提示存在發(fā)表偏倚的可能性較小。

圖3 MRT-PCR檢測 ADV 的 Sen合并(A)、Spe合并(B)、+LR合并(C)、-LR合并(D) 森林圖Fig.3 Forest plot of total sensitivity(A)，total specificity(B)，total+LR(C)，total-LR(D)of MRT-PCR for detection of ADV

3 討論

本研究共納入2 528例病例樣本，Meta分析結果顯示MRT-PCR檢測RSV的Sen合并和Spe合并分別為0.87和0.98，表明其在檢測RSV中具有較高的特異度，但靈敏度有待進一步提高。通常+LR大于10或-LR小于0.1可以作為確定或排除疾病的診斷標準(確診診斷)[17]。本研究中，MRT-PCR檢測RSV的 +LR合并是64.5，表明 MRT-PCR對 RSV的誤檢率較低；-LR合并是0.12，表明在檢測RSV為陰性時尚不能排除RSV為陽性的病例，提示不能排除漏檢情況。本研究檢測RSV的AUC和Q指標分別為1.00和0.97，AUC和Q指標都是同時考慮了靈敏度和特異度的綜合指標，提示 MRT-PCR檢測RSV的綜合能力較好。DOR也是綜合反映靈敏度和特異度的診斷效能指標，本研究中該值為919.76，說明MRT-PCR對RSV具有較好的檢測能力。總之，MRT-PCR檢測RSV的靈敏度有待進一步提高，檢測綜合能力較好。MRT-PCR檢測ADV的 Sen合并和Spe合并分別為0.64 和0.99，+LR合并和-LR合并分別為107.16和0.19，AUC為0.99，Q 指數(shù)為 0.96，DOR合并為 596.29。 提示 MRT-PCR 檢測ADV有極高的特異度，但靈敏度中等，誤檢率較低，漏檢情況不能排除，但MRT-PCR檢測ADV感染的綜合能力較好。

綜合來看，MRT-PCR檢測呼吸道常見RNA病毒RSV和DNA病毒ADV感染的綜合能力較好，但是其對RSV和ADV的漏檢情況尚不能排除，靈敏度還有待進一步提高。通過將多種呼吸道病毒的引物和探針或者引物和熒光染料放到一管里進行檢測，可能對其檢測的靈敏度產生影響；此外本研究納入的文獻檢測RSV和ADV的引物不完全相同，導致報道的檢測靈敏度有差異。因此，MRT-PCR在檢測呼吸道病毒感染時，其靈敏度還可以改善，但檢測的綜合能力較好。

本研究尚存在一些不足，首先，選擇的文獻都是公開發(fā)表的全文，未列入灰色文獻，可能有一定的偏倚；其次，本研究結果存在一定的異質性，但由于納入文獻篇目有限未進行亞組分析；另外，納入文獻中評價MRT-PCR的參考方法存在一定差異，可能對評價結果有些影響；最后，本研究僅對呼吸道病毒感染較常見的RSV和ADV做了評價，在以后的工作中，將會進一步評價MRT-PCR對其他呼吸道病毒的檢測效能。

總之，根據(jù)本研究結果，MRT-PCR對呼吸道常見病毒RSV和ADV的檢測具有較高的特異度，對RSV和ADV的檢測靈敏度還有待進一步提高，但MRT-PCR檢測RSV和ADV的綜合能力較好，值得推薦用于臨床早期診斷呼吸道病毒RSV和ADV的感染。

利益沖突 無