一種肉桂水提物抗單純皰疹病毒1型活性研究

任超 黃茜 王萍 李瑩 楊兆祥 張建文

650100昆明,昆藥集團股份有限公司

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一種雙鏈DNA包膜病毒，根據(jù)血清型不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球約90%的人口感染過皰疹病毒，最常見的是HSV-1，可以潛伏感染，亦可被激活引起皮膚皰疹或生殖器皰疹、結(jié)膜炎、角膜炎、腦炎或皰疹性濕疹等[1]。

目前沒有可用于防治HSV感染的疫苗，臨床常用的治療藥物是以阿昔洛韋(acyclovir，ACV)為代表的核苷類似物。但是，大多數(shù)核苷類藥物都有靶點單一、生物利用度低、半衰期短和副作用嚴(yán)重的缺陷，且長期使用會產(chǎn)生耐藥[2]。因此，尋找新作用機理、毒副性小的抗HSV藥物有實際臨床需求。隨著對天然產(chǎn)物藥物研究的不斷深入，大量天然產(chǎn)物單體、活性部位或復(fù)方被報道具有抗HSV方面的藥理作用，如夏枯草多糖、黃芪總皂苷、青蒿縮合鞣質(zhì)(CTA)、藍花荊芥提取物等[3]。肉桂(Cinnamomum cassia)是我國常用中藥材。本研究以Vero細胞和HSV-1(角膜)感染動物模型研究了肉桂水提物KPC-rg1對HSV-1的抗病毒作用；進一步的，通過體外抗病毒活性實驗探索了KPC-rg1對9種病毒的潛在廣譜抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒:本研究測試的病毒見表1。

1.1.2 細胞株:Hep-2(ATCC CCL-23)，RD(Cell bank of CAS-TCHU 45)，Vero E6(ATCC CRL-1586)，Vero(中科院昆明動物所)，H1 HeLa(ATCC CRL-1958)， MRC5(ATCC CCL-171)，MT-4(NIH AIDS項目)。

1.1.3 實驗動物:雌性BALB/c小鼠與雌性6月齡樹鼩，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.4 藥材與藥物:肉桂購自昆明市官渡區(qū)滇芝堂，經(jīng)鑒定為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹皮。阿昔洛韋(批號:20160811，純度:99.82%，湖北科益藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.5 試劑與儀器:CCK8試劑盒(天津百螢)；CellTiter-Glo試劑盒(Promega)；小牛血清(GIBCO)；DMEM(Thermo Scientific)；SpectraMax340PC384 型酶標(biāo)儀(Molecular Device)；UB-7型pH(丹佛儀器有限公司)；Synergy/HT(BioTek)；Acumen eX3 高內(nèi)涵成像儀(TTP Labtech)；天平(METTLER TOLEDO MS)；離心機(Sorvall biofuge stratos)；XD—202型光學(xué)顯微鏡(江南光學(xué)儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 肉桂水提物KPC-rg1的制備:取肉桂樹皮粉碎，過24目篩，稱取200 g，20℃浸泡提取2 h/次，共3次，合并濾液，濃縮至1 000 ml，加入KCl定容至終濃度0.5 mol/L，用HCl調(diào)pH 至4，靜置24 h，取沉淀部分減壓干燥即得KPC-rg1。

1.2.2 KPC-rg1細胞毒性實驗:Vero細胞鋪板，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，設(shè)實驗組、對照組、空白組，48 h后讀取OD值并計算細胞存活率。

1.2.3 KPC-rg1體外抗HSV-1病毒活性檢測:Vero細胞鋪板培養(yǎng)過夜，將 HSV-1懸液(MOI=5)或HSV-1與不同濃度KPC-rg1混合液滴定于細胞中吸附1.5 h，棄上清并洗3次，前者加入含不同濃度KPC-rg1的細胞維持液，后者僅加細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并計算病毒懸液的TCID50值。

1.2.4 KPC-rg1在HSV-1角膜感染模型中的藥效評價

1.2.4.1 小鼠角膜感染模型:72只小鼠，眼角膜給予空針劃傷后向結(jié)膜囊內(nèi)分別滴人PBS、5μl病毒懸液(滴度為1.0×104PFU/眼)或藥物+病毒懸液。1.2.4.2 樹鼩角膜感染模型:48只樹鼩，100 mg/kg的Ketamine麻醉后，對樹鼩進行眼膜劃痕后將HSV-1病毒滴加于眼膜上(滴度為1.0×106PFU/眼)。

1.2.4.3 實驗分組如下:①空白組②模型組③KPC-rg1組④HSV-1+KPC-rg1孵育組⑤ACV組⑥HSV-1+ACV孵育組。依據(jù)正常動物眼角膜藥物耐受預(yù)實驗數(shù)據(jù)，小鼠模型③-⑥組均設(shè)置3個藥物濃度梯度(即0.2 μg/眼、1 μg/眼、4 μg/眼)，而樹鼩模型設(shè)2個濃度梯度(0.2μg/眼和4μg/眼)，每個濃度4只動物。

1.2.4.4 角膜炎分級或癥狀判斷參照Trousdale標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

1.2.5 KPC-rg1廣譜抗病毒活性篩選(由上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司完成):除HCMV采用熒光衰減實驗測定，其他8株病毒采用細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)實驗測定。KPC-rg1的細胞毒性實驗與抗病毒活性篩選實驗平行進行，除了沒有病毒感染外，其他的實驗條件與抗病毒實驗一致。

圖1 KPC-rg1對Vero細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of Vero cell proliferation by KPC-rg1

圖2 KPC-rg1或ACV給予被HSV-1感染細胞(A)和KPC-rg1或ACV與HSV-1共孵育后感染細胞(B)的病毒載量Fig.2 Viral load of HSV-1 infected cells after KPC-rg1 or ACV treated(A)and cells infected by HSV-1 co-incubated with KPC-rg1(B)

2 結(jié)果

2.1 KPC-rg1的細胞毒性 如圖1所示，當(dāng)KPC-rg1的濃度小于0.1 mg/ml時，對細胞生長基本無毒性，該劑量為進行HSV-1體外抗病毒活性檢測提供了依據(jù)。

2.2 KPC-rg1對HSV-1的體外抗病毒活性 顯微鏡下，Vero細胞被HSV-1感染后呈現(xiàn)典型的細胞皺縮、變圓、碎裂等細胞病變現(xiàn)象。若被感染細胞分別加入 0.0001、0.001、0.01 mg/ml KPC-rg1 或 ACV，病毒載量下降2.2 vs 2.4倍、5.3 vs 5.6倍、6.5 vs 1335倍，呈劑量依賴性對細胞有保護作用(圖2)。

若HSV-1與KPC-rg1或ACV共孵育后再感染細胞，0.001～0.1 mg/ml KPC-rg1對細胞有明顯保護作用，其中0.001 mg/ml和0.01 mg/ml KPC-rg1分別使病毒載量下降5.6和238倍，而ACV在相同濃度下對細胞保護作用較KPC-rg1弱(圖2)。

2.3 KPC-rg1抗HSV-1體內(nèi)藥效評價

2.3.1 小鼠角膜感染模型:正常小鼠眼角膜藥物耐受預(yù)實驗提示KPC-rg1濃度高于5μg/眼時出現(xiàn)嚴(yán)重刺激作用，故該實驗設(shè)置給藥組為0.2μg/眼、1 μg/眼與4 μg/眼。

結(jié)果顯示:對照組HSV-1感染后第3天眼睛出現(xiàn)炎癥、水腫、伴有分泌物和糜面的發(fā)生。感染后第2天開始給藥，持續(xù)7 d，KPC-rg1未能改善角膜病變情況；HSV-1與KPC-rg1共孵育后能有效保護角膜，未觀察到病變。按角膜炎分級判斷標(biāo)準(zhǔn)，各組角膜病變評分統(tǒng)計見表2。

2.3.2 樹鼩HSV-1+角膜感染模型:在樹鼩角膜接種HSV-1后第9、12、19天檢查角膜病變并記錄評分(表3)。KPC-rg1對角膜病變的改善均不明顯，而HSV-1與KPC-rg1共孵育后能有效保護角膜，病變較輕微。

2.4 KPC-rg1廣譜抗病毒活性篩選 KPC-rg1對HIV-1、HCMV、RSV Along和 HSV-1 的 EC50分別為9.24 μg/ml， 42.55 μg/ml， 40.66 μg/ml和 32.74 μg/ml，具有明顯抗病毒活性，而對其他5株病毒沒有表現(xiàn)出抗病毒活性(表4)。

表2 測試病毒感染小鼠角膜病變比較(ˉ±s)Tab.2 Comparison of corneal lesions in each group of mouse infected by tested viruses(ˉ±s)

表2 測試病毒感染小鼠角膜病變比較(ˉ±s)Tab.2 Comparison of corneal lesions in each group of mouse infected by tested viruses(ˉ±s)

組別 造模前 4 d 6 d 8 d空白組 n=12 0±0 0±0 0±0 0±0模型組 n=12 0±0 2.25±0.45 3.5±0.43 3.79±0.33 KPC-rg1組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.29 1.88±0.25 3.00±0.41 KPC-rg1組(1μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 2.25±0.65 3.25±0.29 KPC-rg1組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.25±0.29 2.88±0.48 3.375±0.25 HSV-1+KPC-rg1孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0 ±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(1μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV組(0.2μg/眼)，n=4 0 ±0 0.625±0.25 0.875±0.25 1.00±0 ACV組(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 1.625±0.49 2.625±0.25 ACV組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 3.00±0.41 3.875±0.25 HSV-1+ACV孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 1.00±0.41 1.125±0.25 HSV-1+ACV孵育組(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 2.375±0.25 3.125±0.25 HSV-1+ACV孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 3.625±0.25 3.75±0.29

表3 測試病毒感染樹鼩角膜癥狀比較(ˉ±s)Tab.3 Comparison of corneal lesions in each group of tree shrews infected by tested viruses(ˉ±s)

表3 測試病毒感染樹鼩角膜癥狀比較(ˉ±s)Tab.3 Comparison of corneal lesions in each group of tree shrews infected by tested viruses(ˉ±s)

組別 造模前 9 d 12 d 19 d空白組n=8 0±0 0±0 0±0 0±0模型組n=8 0±0 2.25±0.46 3.375±0.52 0.5±0.53 KPC-rg1組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 1.75±0.5 1.5±0.58 0.25±0.5 KPC-rg1組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.5±0.58 2.00±0.82 0.5±0.58 HSV-1+KPC-rg1孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0±0 0±0 ACV組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0.5±0.57 HSV-1+ACV孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 3.25±0.5 3.50±0.58 2.00±0.82 HSV-1+ACV孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0.75±0.5 0.5±0.57

3 討論

肉桂是重要的藥用和食用植物，在我國地理分布廣，資源豐富。肉桂多酚作為肉桂中水溶性部分，具有多種藥理作用，包括抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護等[6]，但其抗病毒方面的報道則極少。2015年Zaidi小組發(fā)現(xiàn)肉桂水提物及其納米制劑在細胞水平上具有抗禽流感病毒H7N3的活性，但未與現(xiàn)有臨床用藥進行比較[7]；2016年 Prakash與Lortat-Jacob小組研究發(fā)現(xiàn)從肉桂提取的原花青素A型多酚能通過結(jié)合HIV-1病毒外殼糖蛋白而阻止其進入細胞，并可下調(diào)T細胞耗損標(biāo)記物Tim-3、PD-1而具有抗 HIV-1活性[8]；2017年 Baumert與 Moog發(fā)現(xiàn)該原花青素A型多酚還能抑制HCV進入細胞，可能具有治療HCV感染的作用[9]，但兩項研究均未對其體內(nèi)抗病毒活性做進一步探索。

本研究通過體外抗病毒活性和體內(nèi)抗病毒藥效研究評價了肉桂水提物KPC-rg1的抗HSV-1活性。首先，被 HSV-1感染的 Vero細胞加入 KPC-rg1(0.0001～1 mg/ml)后對病毒復(fù)制有抑制作用，而HSV-1與KPC-rg1(0.001～1 mg/ml)共孵育后能保護細胞不被感染。其次，KPC-rg1對HSV-1感染的動物(小鼠和樹鼩)角膜病變有一定的改善作用，而KPC-rg1與HSV-1共孵育后能完全保護動物不被感染。

通過丁達爾實驗觀察到KPC-rg1是一種溶膠，推測其與病毒相遇后快速形成穩(wěn)定的KPC-rg1/病毒超納米顆粒結(jié)構(gòu)，使病毒失去感染細胞的能力。臨床上，HSV-1感染可分為原發(fā)型與復(fù)發(fā)型兩型。KPC-rg1可包裹HSV-1病毒并抑制其感染細胞的特性可減少潛伏或新增殖的病毒對機體造成損傷，緩解患者反復(fù)遭受病痛折磨。。

同時，本研究也顯示 KPC-rg1對 HCMV，RSV Along和HIV-1有顯著的抑制活性，提示KPC-rg1可能具有廣譜的抗包膜病毒活性，值得進一步深入研究。

表4 KPC-rg1抗病毒活性和細胞毒性Tab.4 Antiviral activity and cytotoxicity of KPC-rg1 and references compound

利益沖突 無