2017年北京市東城區EV-A71和CV-A16分離株VP1基因序列特征分析

王聯君 李艷宇

100050北京市東城區疾病預防控制中心

1980年，手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)第1次在我國被報道。HFMD是一種由腸道病毒引起的急性傳染病，病毒型別眾多，優勢毒株不斷發生更替和改變[1]，以往的研究[2-4]顯示HFMD的主要病原體為腸道病毒A組71(EVA71)和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)。但近年一些地區研究[5-6]顯示，引起HFMD的病原以非EVA71非CV-A16的其他腸道病毒為主，EV-A71和CV-A16占一定比例。自HFMD于2008年5月份被衛生部列入丙類傳染病后，北京市東城區每年都進行HFMD監測。本研究通過對北京市東城區2017年分離到的EV-A71和CV-A16毒株VP1序列進行測序和進化分析，為本轄區的HFMD預防提供分子生物學資料。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 來自本轄區哨點監測醫院在2017年1月1日至12月31日期間采集的HFMD疑似病例的咽拭子樣本，通過Real-time PCR測定為腸道病毒通用引物陽性、EV-A71陽性或者CV-A16陽性(江蘇碩世生物科技有限公司)。

1.2 病毒分離培養 將EV-A71及CV-A16核酸陽性的咽拭子按照《手足口病實驗室手冊》(2010版)[7]接種在人橫紋肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD)細胞上，每份樣本盲傳2代，每代培養7 d，將產生細胞病變(CPE)的樣本凍存在-80℃，備用。

1.3 EV-A71和CV-A16 VP1區的擴增及序列測定 將分離到的4株EV-A71和3株CV-A16用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取RNA；VP1引物序列參考文獻[8]設計，用TaKaRa One step RTPCR試劑盒進行RNA反轉錄擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，送上海伯杰生物有限公司進行測序。

1.4 同源性和系統進化分析 用DNAstar 5.0軟件分別對EV-A71和CV-A16 VP1序列的核苷酸和氨基酸的同源性進行比較；用MEGA6.0進行EVA71和CV-A16的VP1序列系統進化樹構建。

2 結果

2.1 HFMD病原監測及毒株分離情況 北京市東城區在2017年1月1日-12月31日期間共檢測HFMD疑似病例咽拭子樣本95份，腸道病毒通用引物核酸陽性46份(占48.42%)，其中EV-A71陽性4份(占4.21%)，CV-A16陽性4份(占4.21%)，非EV-A71非CV-A16其他腸道病毒陽性38份(占40.00%)。EV-A71分離出陽性毒株4株，CV-A16分離出陽性毒株3株；非EV-A71非CV-A16其他腸道病毒陽性樣本上送北京市疾病預防控制中心。

2.2 EV-A71和CV-A16 VP1核苷酸和氨基酸同源性分析 4株EV-A71分離株的VP1基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較高，分別為92.89% ～99.15%和97.32% ～98.66%；而與來自 GenBank中下載的參考毒株的序列比對，這4株EV-A71與C4a基因亞型中的VP1序列核苷酸同源性最高，達到91.87% ～96.60%，其次是C4b亞型。氨基酸同源性在不同型別之間差別不大，同源性高。3株CV-A16分離株的VP1序列核苷酸和氨基酸的同源性也比較高，分別為93.90% ～98.76%和98.32%～100.00%；而與來自GenBank中下載的參考毒株的序列比對看出，這3株CV-A16與B1b基因亞型中的VP1序列核苷酸同源性最高，達到90.91～97.62%，與A基因亞型差異較大。這些CV-A16毒株的氨基酸同源性最高達100%(見表1)。

表1 EV-A71(CV-A16)分離株與EV-A71(CV-A16)參考毒株VP1基因型或亞型的核苷酸和氨基酸同源性比較Tab.1 Comparison of nucleotide and amino acid homology of the VP1 genotype or subtype between EV-A71(CV-A16)isolated strains and EV-A71(CV-A16)reference strains

2.3 EV-A71和CV-A16 VP1種系進化樹分析從圖1可以看出，分離的4株EV-A71病毒與基因庫中整理下載的參考株構建的種系進化樹上有A、B、C、D、E等幾大簇，2017年東城區分離的EV-A71都處于C4a分支，其中3株處在同一小分支上，與2010年鄭州分離株(KC493671)距離較近；另株與這3株距離較遠，和2014年深圳分離株(KT428644)距離較近，形成一小分支。

從圖2可以看出，分離的3株CV-A16病毒株與基因庫中整理下載的參考株構建的種系進化樹上有A、B兩大簇，B又分為 B1和B2兩支，B1分為B1a、B1b、B1c三支；3株 CV-A16都屬于 B1b分支上，與2014年深圳分離株(KM215267)和2013年北京分離株(KP289415)親緣關系近，形成一小分支。

圖1 2017年北京東城區EV-A71分離株與參考株VP1序列親緣關系進化樹Note:●indicates the VP1 coding region of EV-A71 strains in the studyFig.1 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of EV-A71 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

3 討論

HFMD是一種常見傳染病，多發生在低齡兒童中間。自20世紀60年代以來，其暴發和流行越來越頻繁，隨著時間推移和環境的改變，引起HFMD的病原譜不斷發生改變，從北京市東城區2017年HFMD監測結果看出:該監測年度HFMD以非EVA71非CV-A16其他腸道病毒為主，占總檢測樣本的40.00%，EV-A71和CV-A16也占一定比例都為4.21%，陽性率比較低，這與李姍姍[9]等對東城區2013—2015年HFMD實驗室病原學結果分析有所不同，引起這一改變的原因是由于病毒自身變異還是環境的影響有待進一步研究，在今后的監測中應進一步開展其他腸道病毒的基因分型，完善HFMD病原譜。

不同型別的腸道病毒引起的HFMD臨床癥狀相似，但EV-A71可引起嚴重的神經系統損害，甚至死亡[10]，CV-A16臨床癥狀較輕，但也可以引起嚴重的并發癥，如孕婦自然性流產、肺部感染、無菌性腦膜炎等[11]。EV-A71和CV-A16都屬于腸道病毒小RNA病毒科，由單股正鏈RNA組成，其編碼的蛋白經水解酶最終水解形成的蛋白中，VP1蛋白不僅決定病毒的抗原性，也是作為腸道病毒屬內血清分型的依據。本研究對分離陽性的4株EV-A71和3株CV-A16進行VP1基因序列測定分析，結果表明:4株EV-A71 VP1編碼區核苷酸序列與從GenBank中下載的其他型別(A型U22521、B型AB059813)參考毒株核苷酸差異在15.14% ～18.78%之間，同源性較差，通過核苷酸序列比對發現主要是某些核苷酸位點發生改變，但沒有出現大片段的缺失或增加。與C4a亞型代表株(2010年鄭州株KC493671)序列比對中核苷酸同源性為91.87% ～96.60%，氨基酸同源性為96.31% ～98.66%，核苷酸和氨基酸同源性較高，但由于這次分析毒株數有限，EV-A71 VP1序列中核苷酸、氨基酸序列的變化是否對HFMD臨床癥狀及其型別改變有影響需要進行長期監測分析研究。從EV-A71 VP1進化樹上看出，4株EV-A71都位于位于C基因簇中的C4a亞型中，這說明2017年北京市東城區EV-A71毒株比較穩定，基因型集中，與趙曦[12]、于秋麗[13]、陳瑞珊[14]等研究一致。4株EV-A71分離株中3株聚集成一簇，與鄭州株(KC493671)進化距離很近，而與另1株(BJDC-EVA71-2)距離較遠，這提示東城區2017年EV-A71可能存在不同的病毒來源，能否引起不同的傳播鏈需要進一步動態監測。有文獻[15-16]將CV-A16分為A、B兩個基因型，B型又分為B1和B2兩個基因亞型，B1基因亞型可被進一步分為B1a、B1b和B1c亞型，本次研究的3株CV-A16 VP1編碼區核苷酸序列與從GenBank中下載的其他型別(A型U05876、B2型AB465370)序列相比較，其中核苷酸位點發生多處改變，導致其核苷酸同源性較差，但也沒有發生大片段的缺失和增加。這3株CV-A16與2014年深圳代表株(KM215267)核苷酸和氨基酸同源性很高，都屬于 B1b型，與國內其他監測一致[8，17-18]。

圖2 2017年北京東城區CV-A16分離株與參考株VP1序列種系進化樹Note:●indicates the VP1 coding region of CV-A16 strains in the studyFig.2 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of CV-A16 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

由于本次研究只選取北京東城區2017監測年度年中分離的 EV-A71和CV-A16毒株進行分析，結果受到時間、地域和毒株數量的限制，繪制的親緣進化分析結果會有一定偏倚。因此，要想準確掌握本轄區HFMD病原譜構成及病毒的變異進化特征，就需要長期監測獲得更多的數據，從而為HFMD的預防控制提供基礎資料。

利益沖突 無