青海省2016—2017年人腸道病毒A組71型基因特征

范麗霞 王衛軍 巴卓瑪 趙生倉 李崇亥 姜雙應 嚴冬梅 冀天嬌

810007西寧,青海省疾病預防控制中心衛生檢驗檢測中心(范麗霞、王衛軍、巴卓瑪、趙生倉、李崇亥、姜雙應);102206北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(嚴冬梅、冀天嬌)

手 足 口 病 (hand， foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒(human enterovirus，HEV)引起的傳染病，其中以腸道病毒A組71型(human enterovirus group A type 71，EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16，CV-A16)感染最為多見。自1974年Schmidt等[1]首次報道以來，全世界很多國家和地區先后報道了EV-A71的感染和流行情況[2-3]。近10年的流行病學研究顯示，全球各地HFMD暴發流行主要是由EV-A71引起[4-9]。青海省從2008年開始，每年對EV-A71的流行情況進行監測，實驗室數據顯示2012、2013、2015和2017年以EV-A71為優勢病毒株，實驗室核酸檢測陽性標本中EV-A71所占的比例分別為93.71%、65.52%、40.81%和42.15%。本文對2016—2017年青海省HFMD的主要病原體EV-A71的基因特征進行分析，加強對EV-A71的分子流行病學監測，了解EV-A71的基因特征，對預防和控制EV-A71的暴發具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標本采集 收集2016—2017年青海省三家哨點醫院的患者咽拭子標本566份，和8個市(州)級網絡實驗室核酸檢測陽性標本585份。

1.2 核酸檢測 按照衛生部發布的《HFMD標本采集及檢測技術方案》[10]，采用江蘇碩世病毒核酸提取試劑盒對咽拭子標本進行病毒RNA提取，提取步驟按說明書操作進行。采用江蘇碩世rRT-PCR分型試劑盒對所有標本進行EV-A71、CV-A16和其他HEV檢測。

1.3 病毒分離 對核酸檢測為陽性的標本采用人橫紋肌肉瘤細胞(human rhabdomyosarcoma，RD)細胞進行病毒分離，RD細胞由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家脊髓灰質炎實驗室提供。每1份標本接種2支RD細胞，每支接種0.2 ml的標本懸液，置36℃培養7 d。每天觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)并進行記錄。每份標本在RD細胞上至少傳兩代，出現腸道病毒特異的CPE后，保存在—20℃條件下待用。

1.4 EV-A71全長VP1編碼區擴增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，USA)提取病毒核酸。使用PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit Ver.2(TaKaRa，大連)試劑盒對分離的EV-A71毒株全長VP1編碼區進行擴增，擴增引物參照文獻[11]。

1.5 核苷酸序列測定 擴增后的陽性產物使用QIA-quickPCR purification kit(Qiagen，USA)試劑盒純化，然后分別使用上下游引物，按Big DyeTM Terminator V3.0 CycleSequencing Ready reaction(Applied Biosystems，USA)試劑盒中的標記反應條件進行雙向標記反應。標記產物經葡聚糖凝膠G-50(Pharmacia，Sweden)純化后，于 ABI 3500型序列測定分析儀上(Applied Biosystems，Japan)自動測序和分析。

1.6 生物信息學分析 使用序列的校對和整理軟件Sequencher 5.0進行序列圖譜整理，使用分子進化遺傳分析(Molecular Evolution Genetics Analysis，MEGA)6.0軟件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的ClustalW 軟件包進行多序列比對，并采用鄰接法(Neighborjoining，NJ)構建基于EV-A71毒株VP1編碼區的親緣關系樹。

2 結果

2.1 EV核酸檢測 2016—2017年青海省各網絡實驗室及監測哨點醫院共采集HFMD病例標本1 446份，病毒核酸檢測陽性 984份，總陽性率為68.05%。

2.2 病毒分離與陽性分離物的RT-PCR鑒定984份標本在RD細胞上進行病毒分離，經觀察出現典型腸道病毒CPE的有164株病毒，經rRT-PCR腸道病毒定型，114株鑒定為EV-A71。

2.3 用于研究的病毒 114份EV-A71的分離物分別分離自114例HFMD病例。相關病例年齡≤13歲，男性60例，女性54例，性別比1.11∶1。2016年分離15株，2017年分離99株，分別來自青海省西寧市(68株)、海東市(44株)和海北州(2株)。

2.4 EV-A71分離株VP1編碼區核苷酸序列親緣進化樹分析 114株青海省EV-A71分離株的VP1區核苷酸序列的長度都是891個核苷酸，編碼297個氨基酸。從GenBank數據庫下載54個各基因型及基因亞型(A～G，C1～C5)VP1區核苷酸參考序列，分別包含來自歐洲、亞洲、美洲和澳洲1970—2013年的代表株，其中C4代表株主要來自于中國，與114株青海省EV-A71分離株進行核苷酸序列同源性分析。2016—2017年，EV-A71毒株VP1編碼區核苷酸序列與C4基因亞型代表株具有最高同源性，為89.8% ～96.7%。C4基因亞型又分為C4a和C4b分支，本研究毒株與C4a(我國本土代表序列)和C4b分支核苷酸序列同源性分別為94.4%～96.7%和89.8%～92.7%。本研究毒株相互間的核苷酸序列同源性為91.5% ～100%，氨基酸序列同源性為9 8.3% ～1 0 0%。其中，2 0 1 6年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為2.3%和0.4%；2 0 1 7年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為3.4%和0.8%；2 0 1 6與2 0 1 7年毒株，核苷酸和氨基酸序列平均差異為3.6%和0.7%。

圖1 基于VP1編碼區(891bp)構建青海2016—2017年分離株與其它EV-A71代表毒株的親緣性進化樹Note:green dots represent EV-A71 strains of 2016，red dots represent EV-A71 strains of 2017Fig.1 Phylogenetic tree of EV-A71 isolates was constructed based on the VP1 coding region(891bp)in Qinghai province from 2016 to 2017)

2016—2017年青海省流行的EV-A71可以被劃分為2個進化分支，即lineage1和lineage2，分別包含100株和14株EV-A71。lineage1與lineage2兩組間的核苷酸與氨基酸差異分別為6.95%和1.19%。其中 lineage1包含絕大多數(13/101，87.12%)的2017的 EV-A71毒株和幾乎全部的2016年EV-A71毒株，分布于西寧市和海東市，是本省流行優勢分支。而lineage2僅有1株分離自2016年的EV-A71毒株，其余均為2017年毒株。可見青海省的EV-A71傳播鏈并不唯一，且在2017年進化為較為明顯的2個傳播鏈(圖1)。

3 討論

HFMD是由多種腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。由于腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快等特點，HFMD常出現暴發或流行。開展HFMD流行特征及病原學監測對于防控策略的制定具有重要意義。而HFMD分子流行病學監測是其中的重要組成部分，也是HFMD監測系統在實驗室網絡方面最重要的任務之一。

青海省2016—2017年分離到的114株EV-A71大部分來自人口相對密集的西寧市和海東市，經核苷酸同源性和基因親緣性關系分析，證實全部屬于C4基因型中的C4a基因亞型，和全國的流行情況一致[5]。青海省2016—2017年114株EV-A71分屬2個不同分支，說明引起青海HFMD流行的EV-A71傳播鏈并不唯一。同時，基于基因親緣性關系樹發現，青海省不同傳播鏈上的EV-A71，分別與近年來在中國其他省流行的C4a基因亞型EV-A71在基因親緣關系和流行時間關系上都很接近，說明青海省EV-A71不是獨立進化的，而是與中國其他省流行的EV-A71在共同進化。

盡管HFMD的實驗室監測在青海省已經開展，建立了青海省HFMD的EV-A71毒株庫和基因資源庫，積累了一定的EV-A71分子流行病學研究數據，但是青海省EV-A71監測系統還比較薄弱，偏遠的玉樹州、果洛州報告病例少，未開展采樣和實驗室檢測工作，因而得到的數據還不全面，應進一步加強并擴大監測范圍，建立青海省完整的EV-A71分子流行病學基線數據，以全面了解并闡明青海省流行EV-A71的基因型和基因亞型的特征，更好的為青海省HFMD的監測與防控提供實驗室參考。

利益沖突 無