腸道病毒5′-非翻譯區測序分型的應用評估

唐詩歡 謝爭華 劉朵朵 袁穎 陳滿君 范笑地 丁細霞 余楠

510282廣州,南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部廣東省突發傳染病病原微生物重點實驗室

腸道病毒(enterovirus，EV)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，有12個種(A-L)，150多個血清型[1]。EV是常見病原體，引起手足口病、腦炎和呼吸系統疾病等，不同血清型導致的疾病有所區別[2]。除國內主要流行的腸道病毒A組71型(EVA71)、柯薩奇病毒A組16型(cosackievirus A group 16，CoxA16)和6型(CoxA6)，以及引起呼吸道感染的腸道病毒D組68型(enterovirus D68，EVD68)外，其他血清型EV的感染情況、疾病特征、預后等，相關資料較少。EV血清型鑒定目前主要用于流行病學監測，臨床實驗室較少開展。

EV基因組為單股正鏈RNA，其中5’-非翻譯區(5′-untranslated region，5′-UTR)基因序列高度保守，適合作檢測靶標，用于EV初篩。衣殼蛋白 VP1(viral protein 1)、VP2、VP4決定了 EV 的抗原性，用于血清型分型[3-5]，其中VP1區分型與血清型完全對應，被認為是最準確的分型靶標[6]。一般無需病毒分離，可采用巢式逆轉錄PCR直接擴增、測序標本的病毒VP1區，缺點是操作繁瑣，敏感度低，檢出率約60%[7-8]。有學者認為5′-UTR對血清型區分有一定價值[9-10]，雖非分型首選方法，但敏感度高。5′-UTR分型對于國內流行的主要EV血清型的適用程度如何，目前較全面的評價資料不多。本研究利用近年確認的EV感染者呼吸道、腸道的臨床標本600余例，比較5′-UTR與VP1區測序分型以及型特異性VP1區 RT-PCR檢測結果，評價5′-UTR分型的性能，為其應用于EV血清型相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 拭子采自就診于南方醫科大學珠江醫院的有發熱、出疹(手足皰疹、口腔潰瘍等)、呼吸道癥狀(咳嗽、流涕、呼吸急促等)、神經系統癥狀(抽搐、驚厥、肌痙攣、昏迷等)等疑似EV感染的病例。采集后立即冰盒送至實驗室，-80℃保存備用。2016年1月到2017年12月采集肛拭769份，2014年1月到2017年12月采集鼻拭2 416份，標本采集征得患者知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 核酸提取:采用 Viral RNA Mini Kits(Qiagen，德國)，按說明書操作。

1.2.2 EV初篩:采用EV通用型熒光定量PCR試劑(之江，中國)，篩查為陽性的標本納入研究。按試劑盒說明操作和判斷結果。

1.2.3 以5′-UTR區擴增比對分型(簡稱5′-UTR法):引物及反應條件來自文獻[10-11]。

1.2.4 以VP1區擴增比對分型(簡稱VP1法):引物及反應條件來自文獻[12]。

1.2.5 型特異性 RT-PCR:EVA71、CoxA16、CoxA6和CoxA10分別采用型特異性熒光定量PCR試劑盒，按說明操作。EVD68特異性巢式PCR引物及反應條件來自文獻[13]。

1.2.6 測序分型:生工生物工程(上海)公司測序，序列在GenBank上比對，根據比對同源性的高低獲得腸道病毒血清型。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0軟件。采用2×2表格(對照方法/研究方法)分別計算靈敏性、特異性，卡方檢驗進行兩個率的比較，kappa檢驗分析方法一致性。

2 結果

2.1 不同標本類型EV分型 769例肛拭和2 416例鼻拭經EV通用型核酸篩查為陽性的共有666例，分別是518例肛拭(陽性率67.4%)和148例鼻拭(陽性率6.1%)。進一步EV分型:5′-UTR法成功553例，VP1法成功318例 (83.0%Vs 47.7%，P＜0.001)。518例肛拭中，5′-UTR法分型成功434例，VP1法274例(83.8%Vs 52.9%，P＜0.001)；148例鼻拭中，5′-UTR法分型成功119例，VP1法44例(80.4%Vs 29.7%，P＜0.001)。

肛拭(VP1/5′-UTR至少1種)檢出最多的5種血清型分別為:CoxA6(217/518，41.9%)、CoxA16(88/518，17.0%)、EVA71(40/518，7.7%)、CoxA10(28/518，5.4%)和 CoxA4(27/518，5.2%)；鼻拭檢出率最高的血清型為EVD68(15/148，10.1%)。由于兩種方法對部分鼻拭中的EV僅能區分為鼻病毒A、B、C組，故不再分析對鼻病毒血清型的分型性能。

2.2 以VP1法為對照的5′-UTR法分型性能評估以VP1法為參考，5′-UTR法對不同血清型的分型性能有差別。肛拭主要檢出的5種血清型中，5′-UTR法對CoxA6、EVA71和CoxA10的靈敏性較好(91.3～93.3%)，CoxA4較差(70.6%)，CoxA16最差(57.1%)；對EVA71、CoxA10和CoxA4的特異性很好(97.4% ～98.1%)，CoxA6和 CoxA16其次(84.3% ～86.5%)；兩種分型方法對 EVA71和CoxA6一致性較好(kappa值 0.706～0.847)，CoxA10和 CoxA4一般(0.601～0.654)，CoxA16最差(kappa值0.188)。 對于鼻拭檢出的 EVD68，5′-UTR法靈敏性為100.0%，特異性為91.1%，但兩種方法一致性差(kappa值0.217)，見表1。

2.3 以VP1法結合型特異性RT-PCR為對照的5′-UTR法分型性能評估 對5′-UTR法分型陽性而VP1法陰性的標本，進一步采用型特異性RT-PCR驗證，分別有 CoxA6(51/56)、CoxA16(41/67)、EVA71(6/9)、CoxA10(13/13)和 EVD68(10/13)得以確認。以VP1法結合型特異性RT-PCR為參考，5′-UTR法對上述血清型的靈敏性分別提高為:93.4%、85.5%、97.2%、96.4%和100.0%，特異性提高為98.4%、94.3%、99.4%、100.0%和97.8%，兩種方法一致性好(kappa值0.713～0.981)，見表2。

表1 腸道病毒5′-UTR分型的診斷性能Tab.1 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV compared with VP1 serotyping

表2 對照腸道病毒VP1區分型和型特異性RT-PCR的5′-UTR分型性能Tab.2 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV

3 討論

我國EV感染人數居高不下，僅手足口病，2012年至2017年，年報告達182.8萬 ～277.9萬例。CoxA16和 EVA71為常見的血清型，近年 CoxA6、CoxA10出現增多趨勢[14-15]。曾在歐美引起嚴重呼吸和神經系統疾病的EVD68，近年也在亞洲多個地區有所報道[13，16-17]。不同血清型EV引起的疾病有差別，各型間無交叉免疫力，因此，準確、高效的EV血清型鑒定不論對臨床診治還是疾控監測，均有意義。

傳統的EV血清型鑒定依賴病毒分離及中和試驗，方法耗時、昂貴。VP1蛋白包含主要的中和抗原決定簇，序列可用于血清型鑒定，但針對VP1區的簡并引物難適應復雜變異，擴增效率低，不同血清型檢出率差異大[18]。5′-UTR分型具一定敏感度和特異性[9]，Ge等人[9]以型特異性RT-PCR為對照，采用5′-UTR分型方法檢測了4種血清型、40份臨床樣本，認為分型結果可接受。該法對我國近年EV流行株分型性能的評價資料有限，本研究納入近四年的臨床樣本，涵蓋更多血清型，評價可更客觀。

針對5′-UTR 設計的方法有多種[9，11]，本研究所用方法最早用于鼻病毒分型[10]，后有學者將其應用于EV分型，也有較好效果且操作簡便[11]。本研究發現，除 CoxA16外，該法對 CoxA6、EVA71、CoxA10和EVD68等幾種主要血清型的分型能力較好。VP1分型方法也有多種，本研究采用的方法[12]自2006年發表以來，為全世界眾多實驗室采用，本實驗室前期也小樣本量比較了幾種類似方法，因該法成功率略高而沿用。

對于兩種樣本類型，5′-UTR法的分型成功率均較VP1法高。影響分型效果的主要是方法設計，如簡并引物對目標區域的匹配度、不適應復雜變異等，其次可能與病毒載量有關。Kiang等[10]以VP4/VP2分型為參考，考評5’-UTR分型，發現兩種方法對病毒液的分型成功率高且一致性好，對臨床標本則VP4/VP2擴增效率很低，而5’-UTR能成功擴增分型，推測與病毒載量有關。本研究也發現即使同一標本，兩種方法擴增亦有差別。

為確認5′-UTR法診斷陽性而VP1法診斷陰性的這部分結果源自前者的非特異性還是后者的低敏感度，本研究采用型特異性RT-PCR鑒定，分析顯示各血清型EV的診斷敏感度和特異度均有提高，提示兩種方法不一致主要是VP1法低敏感度低導致。CoxA4由于例數較少，未對該型進一步驗證。

綜上，5′-UTR法對EV血清型的診斷效果尚可。即使樣本來自同一部位，如肛拭，其對不同血清型EV的診斷性能也有差異，因此應用時，應根據研究目的綜合考慮。對于臨床感染病例的研究，可考慮5′-UTR初步分型加型特異性RT-PCR確認的思路。

利益沖突 無