遼寧省首例D8基因型麻疹病毒的分離與鑒定

王艷 郝爽 王文思 韓一楠 方興 姚文清

110005沈陽,遼寧省疾病預防控制中心免疫規劃所(王艷、郝爽、王文思、方興、姚文清);116021大連市疾病預防控制中心免疫規劃所(韓一楠)

麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的急性呼吸道傳染病，臨床以發熱伴出疹為主要癥狀。2010年12月，世界衛生組織(world health organization，WHO)消除麻疹定義為:麻疹監測系統(measles surveillance system，MSS)運轉良好的前提下，明確的地理區域內無本土麻疹病毒傳播≥12個月[1]。因此病毒基因型的基線調查是做好麻疹消除工作的前提。近20年的監測顯示遼寧省流行的麻疹野病毒基因型均為H1a[2]。2018年5月，遼寧省首次在大連1例麻疹患者的咽拭子標本中分離并鑒定出D8基因型病毒。

1 材料與方法

1.1 病例來源 該病例相關信息均來自遼寧省MSS。

1.2 標本采集、運送和初步篩查 按照全國麻疹監測方案要求，采集病例咽拭子和血標本并運送到市級麻疹實驗室進行檢測。血標本用ELISA法同時檢測麻疹和風疹IgM抗體；提取咽拭子中的病毒核酸并使用熒光PCR法檢測麻疹和風疹病毒核酸。按照遼寧省麻疹網絡實驗室要求，對核酸篩查陽性的咽拭子標本在10日內上送至省疾病預防控制中心分離病毒和基因分型。

1.3 病毒分離 按照《麻疹診斷》WS 296—2017附錄B.1處理標本并將標本接種至單層Vero/Slam細胞，逐日觀察細胞是否產生病變(CPE)。如出現麻疹病毒典型的融合CPE可連續傳至3代后收獲，3代后仍無CPE的視為陰性棄去。

1.4 毒株鑒定 使用RT-PCR方法對收獲的毒株進行鑒定。使用Qiagen公司 One-Step RT-PCR Kit擴增MV H基因全長和N基因羧基末端的676個核苷酸。實驗條件及引物序列參照文獻[3]。

1.5 序列分析 將PCR產物送北京Invitrogen生物技術有限公司測序。將返回序列與WHO MV 24個基因型的參考株序列，使用MEGA 5.0軟件分別對H基因和N基進行核苷酸和氨基酸的變異比對分析，并構建基因親緣關系進化樹。

2 結 果

2.1 病例的流行病學 病例為男性，1983年出生，大連市戶籍，待業。2018年4月30日出現發熱和呼吸道卡他癥狀，5月1日出現皮疹，臨床診斷為麻疹并進行網絡直報。患者不清楚是否接種過麻疹疫苗，發熱前7～21 d無外出史，無醫院就診史，與明確感染出疹性疾病患者無接觸史。

2.2 血清麻疹、風疹IgM抗體檢測和咽拭子核酸檢測 麻疹IgM抗體和病毒核酸均為陽性，風疹IgM抗體和病毒核酸均為陰性。該病例為麻疹實驗室確診病例。

2.3 病毒分離、復核和標準命名 接種咽拭標本的細胞于第一代就出現了典型的融合病變，轉種至3代后收獲病毒。該病毒序列經國家麻疹參比實驗室復核并確認為D8基因型。按照WHO麻疹野病毒的標準命名方法，將該麻疹病毒分離株命名為:MVi/Liaoning.CHN/18.18/1。

2.4 D8基因型確定 將遼寧省D8基因型麻疹病毒與WHO 24個基因型參考株、GenBank上下載的北京、香港的D8基因型麻疹病毒流行株和2017—2018年麻疹病毒D8基因型其他國家流行株基于N基因羧基端450個核苷酸序列構建基因親緣關系進化樹(圖1)。MVi/Liaoning.CHN/18.18/1麻疹野病毒與WHO D8基因型麻疹病毒參考株MVi/Manchester.GBR/30.94/D8最為接近，其 Bootstrap值為98.9%。該分離株屬于D8基因型。

2.5 遼寧D8基因型麻疹病毒分離株H和N基因變異分析 遼寧株與WHO D8基因型參考株Manchester.GBR/30.94 N基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.9%和97.3%；H基因核苷酸和氨基酸同源性均為98.9%。與中國優勢流行H1參考株Hunan.CHN/93/7 N基因核苷酸和氨基酸同源性分別為92.4%和91.3%，H基因核苷酸和氨基酸同源性分別為93.8%和95.8%(表1)。

3 討 論

麻疹病毒基因型別分布具有明顯的地理特征，并且野病毒流行與年代存在一定的相關性[4]。D8基因型麻疹病毒主要流行于印度、孟加拉等南亞國家，美國和澳大利亞近年來也多次監測到D8基因型的流行。中國首例輸入性D8基因型麻疹病例由上海市疾病預防控制中心于2012年報道[5]。2013年在北京出現2起由D8基因型麻疹病毒感染引起的暴發疫情，2016年之后又在廣東、湖北、內蒙古、云南和安徽等省出現D8病毒的傳播(GenBank上未獲得相應序列資料)。經分析遼寧省此次D8基因型病毒與GenBank上傳的中國香港2012—2016年流行序列100%同源，與2018年在哥倫比亞分離的MVi/LosPatios.COL/11.18/D8序列同源性為100%。與2013年北京流行的D8基因型麻疹病毒處于不同的分支。

圖1 遼寧省D8基因型麻疹病毒分離株與WHO各基因型參考株構建的基因親緣性關系樹D8 genotype strains of China；2017-2018 D8 genotype strains from other countries；WHO D8 genotype strain；Liaoning isolateFig.1 The phylogenetic tree of Liaoning D8 strains compared to the WHO reference strains for each genotype

自患者確診為麻疹后經過1個麻疹最長的潛伏期，未發現2代病例，大連麻疹疫情平穩。H基因變異分析顯示，該D8麻疹病毒分離株與疫苗株S191相比在重要抗原位點變異程度與遼寧H1分離株相似，結合流行病學信息表明通過疫苗接種或者自然感染本土H1a基因型麻疹病毒后，體內產生的抗體對阻斷D8基因型病毒的擴散和傳播起一定作用。

遼寧D8基因型毒株與2016年于安徽和上海流行的D8基因型麻疹病毒同源性均為100%(國家麻疹實驗室未發表數據)，因此推測D8基因型有可能已經在我國呈現小范圍流行，該推測還需要綜合分析全國麻疹病毒學監測數據進行進一步研究加以證實。隨著我國本土H1基因型麻疹病毒傳播的減少，非本土基因型麻疹野病毒的輸入就會凸顯，越來越多的病毒基因型輸入引起的病例就會被監測到。需要加強流行病學和實驗室監測，密切追蹤D8基因型麻疹病毒在我國的流行態勢，以便采取有效措施及時阻斷該病毒在我國的進一步轉播。

表1 遼寧省D8基因型麻疹病毒分離株與24個WHO不同基因型參考株N和HN基因平均遺傳距離Tab.1 N and H mean p-distances for nucleotides and amino acids for measles viruses D8 isolated of Liaoning province with WHO 24 genotype representative strains

利益沖突 無