巨細胞病毒在平滑肌細胞表型轉化中的作用及調控機制

易立 曲媛 郭芳 湯劼 魏田力

100050北京,首都醫科大學附屬北京友誼醫院神經內科(易立、曲媛、郭芳),兒科(魏田力);100050北京,首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科(湯劼)

隨著社會老齡化的加速，心腦血管病已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病，其最主要的病變基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)涉及到AS病變發生、發展的全部過程。VSMC由收縮表型轉化為合成表型的過程稱之為表型轉化。VSMC表型轉化是易損斑塊、支架術后再狹窄和動脈粥樣硬化等血管性病變發生發展過程中的關鍵性步驟[1]。

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于皰疹病毒科β亞科，是一種廣泛存在于自然界的機會致病性病毒。既往研究證實CMV所致的慢性潛伏性感染與動脈粥樣硬化的形成發展密切相關[2]。原發性CMV感染首先累及內皮細胞，隨后在VSMC內潛伏或持續性感染，導致VSMC的肥大、增殖和遷移，對AS的形成及狹窄起重要作用[3]，但CMV感染是否參與VSMC表型轉化的過程目前尚未明確。

PI3K/Akt信號通路是調節VSMC表型轉化的主要信號通路[4]，有文獻報道，其下游轉錄激活因子FoxO通過與促血管平滑肌細胞分化因子Myocardin的協同作用來調控表型轉化標志基因的表達。

本實驗以平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)分別作為VSMC收縮型和合成型的標志基因，旨在通過體內和體外實驗證實CMV是否參與VSMC的表型轉化過程，以及其可能的作用途徑和機制。

1 材料與方法

1.1 制備小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV) 感染致動脈粥樣硬化的apoE-/-小鼠模型MCMV Smith株購自美國典型生物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，通過空斑形成實驗確定小鼠巨細胞的滴度為2×105PFU。8周齡雄性apoE-/-小鼠，體質量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2014-0004，SPF級環境，高脂飼料喂食(購自北京科澳飼料有限公司，21%豬油，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉)。適應性飼養1周后開始實驗。將動物隨機分為感染組和正常對照組，每組12只，感染組予2×105PFU MCMV 200μl腹腔注射，對照組予等量的DMEM腹腔注射。分別于實驗第8、12、16周從兩組各隨機選取1只小鼠，通過超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(MS-550高頻寬帶電子線陣探頭，頻率40 MHz)判斷小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成情況，決定取材時間。

1.2 apoE-/-小鼠主動脈取材、HE染色及免疫組化檢測 ApoE-/-小鼠禁食水8 h后稱重，取血。麻醉后取腹側正中線切口，暴露主動脈及其分支。切取主動脈起始至左鎖骨下動脈開口段，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續切片。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集apoE-/-小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊面積、管腔面積。每個指標選取4個不同切面，取平均值進行統計。免疫組化檢測各組小鼠主動脈斑塊中平滑肌表型轉化的標志蛋白SM22a和OPN的表達。

1.3 小鼠主動脈血管平滑肌細胞(MOVAS)的培養 MOVAS細胞購自美國ATCC，用含10%PBS的細胞培養液，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞融合至70% ～80%，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，按1∶4傳代，選取第3～5代進行實驗。MOVAS細胞分為兩組，實驗組將MCMV與MOVAS共同孵育，對照組加入等量的DMEM，24 h后收集細胞進行實驗。

1.4 小鼠主動脈血管平滑肌細胞(MOVAS)表型轉化相關指標的檢測 應用不同滴度MCMV刺激MOVAS細胞，MTT法檢測不同時間點各滴度MCMV對MOVAS細胞增殖的影響。選取MOVAS細胞增殖最明顯的MCMV滴度作為實驗組，并以正常MOVAS細胞作為對照組。應用Western blot檢測兩組細胞表型轉化標志蛋白SM22a和OPN的表達。

1.5 MCMV對MOVAS表型轉化PI3K/Akt通路的作用 應用Western blot分別檢測對照組和實驗組PI3K/Akt通路中的Akt、磷酸化的Akt表達水平。給予特異性的PI3K通路的抑制劑Ly294002后，應用Western blot檢測兩組平滑肌細胞表型轉化標志蛋白SM22a和OPN的表達情況。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 apoE-/-小鼠主動脈HE染色及免疫組化結果實驗第16周，小動物超聲檢查顯示感染組主動脈壁內膜增厚，連續性中斷，并可見動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內回聲略高于內膜。對照組未見明顯斑塊形成。因此，本研究選擇飼養16周時進行主動脈取材。apoE-/-小鼠主動脈HE染色觀察脂質斑塊發現，對照組和感染組小鼠16周時動脈斑塊面積分別為(3.16±0.72)%和(28.71±3.07)%，感染組的動脈粥樣硬化斑塊的程度較正常飲食組嚴重(P=0.007，圖1)，且二者相比差異有統計學意義。

圖1 飼養16周時正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈HE染色(×40)Fig.1 HE staining of aorta in control and infection group of apoE-/-mice after 16 weeks of feeding(×40)

免疫組化染色結果顯示，對照組的10個主動脈中有9個SM22a染色陽性，SM22a陽性染色顆粒主要位于血管壁富含平滑肌細胞的中膜和外膜，而OPN染色陽性的主動脈則只有1個。CMV感染組的結果與對照組相反，10個主動脈中2個SM22a染色陽性，而OPN染色陽性的主動脈則多達10個，OPN陽性染色顆粒主要位于血管壁的中膜、外膜以及粥樣硬化斑塊中(圖2、3)。在未出現明顯動脈粥樣硬化斑塊的對照組中，動脈壁以表達收縮期蛋白為主；在MCMV感染組，動脈粥樣硬化程度加重，動脈壁中高表達的收縮期蛋白被合成期的蛋白所取代，說明MCMV感染促使動脈粥樣硬化進展的同時，誘導了平滑肌細胞的表型轉化。

2.2 MCMV感染對MOVAS表型轉化指標的影響 觀察不同滴度及時間下MCMV對MOVAS細胞增殖能力的影響，發現在24 h誘導3×104PFU滴度的MCMV誘導細胞增殖最明顯(表1)。

圖2 正常組(×100)和感染組apoE-/-小鼠主動脈SM22a免疫組化染色(×40)Fig.2 SM22a immunohistochemical staining of aorta in normal group(×100)and infection group of apoE-/-mice(×40)

圖3 正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈OPN免疫組化染色(×100)Fig.3 OPN immunohistochemical staining of aorta in normal group and infection group of apoE-/-mice(×100)

表1 不同滴度MCMV誘導MOVAS細胞增殖情況Tab.1 The proliferation of MOVAScells induced by different titers of MCMV

Western blot結果顯示，3×104PFU MCMV感染MOVAS 24 h細胞后，SM22a表達較對照組下降，OPN表達較對照組增加，且兩組與對照組相比差異均有統計學意義(P=0.023，P=0.034，圖4、5)。

2.3 MCMV對MOVAS表型轉化PI3K/Akt通路的調控 為明確PI3K/Akt通路在MCMV促平滑肌細胞表型轉化中的作用，本研究檢測了磷酸化的Akt蛋白的表達水平，結果發現MCMV明顯刺激磷酸化Akt蛋白表達上調(P=0.035)。本研究預先用PI3K的抑制劑Ly294002(10-6mol/L)孵育MOVAS 30 min后，用3×104PFU滴度的MCMV刺激24 h，LY294002可阻斷MCMV感染后的Akt蛋白磷酸化(P=0.031)，而對對照組無明顯影響(P=0.081，圖6)，提示MCMV促平滑肌細胞表型轉化可能經由PI3K/Akt信號通路介導。

圖4 SM22a蛋白在對照組和實驗組的表達Fig.4 Expression of SM22a protein in the control group and the experimental group

圖5 OPN蛋白在對照組和實驗組的表達Fig.5 Expression of OPN protein in control group and experimental group

圖6 LY294002預處理前后，對照組和感染組磷酸化的Akt蛋白表達1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)，?? compared with the MCMV group(P＜0.05)Fig.6 Expression of phosphorylated Akt protein in control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

圖7 顯示單獨 LY294002對MOVAS表型轉化收縮期標志蛋白SM22a的表達無影響，但MCMV+LY294002組的SM22a蛋白表達較MCMV組明顯上調，且與對照組相比統計學差異消失。說明LY294002可明顯抑制MCMV促平滑肌細胞表型轉化的作用，進一步提示PI3K/Akt信號途徑可能參與了MCMV促平滑肌細胞表型轉化的過程。

圖7 LY294002預處理前后，對照組和感染組MOVAS細胞中SM22a蛋白的表達1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)Fig.7 Expression of SM22a protein in MOVAS cells of control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

3 討論

VSMCs的表型決定了細胞的生物學特性和功能[5]。正常VSMCs是收縮型，VSMCs表型由收縮型向合成型轉化是其增生的先決條件。生理情況下，VSMC處于非增殖狀態，表現為分化良好的收縮表型。血管損傷后，VSMC轉化為增殖性的合成表型，合成和分泌多種血管活性物質；同時自身發生肥大，增殖和遷移，導致管壁增厚、管腔狹窄。SM22α是一個22×103的細胞骨架蛋白，其功能涉及血管平滑肌細胞的收縮調節，被認為是收縮表型的標志物之一。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是細胞外基質中一種富含唾液酸的磷酸化糖蛋白，最早從骨基質分離，是合成型細胞的標記基因，它的出現代表血管平滑肌細胞進入了合成型，具有了活躍的增殖與遷移能力。電鏡下，典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應具有明顯的形態、結構區別。前者核小、染色質致密，胞漿富含收縮蛋白、肌絲，而較少內質網、高爾基復合體等合成、分泌性細胞器。而后者則核大、染色質疏松，少肌絲，但卻富含合成、分泌性細胞器。

CMV感染首先累及內皮細胞，隨后在VSMC內潛伏或持續性感染，導致VSMC的肥大、增殖和遷移[6]。研究發現，在CMV所致的apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，收縮表型標志蛋白SM22α較對照組表達明顯減少，而合成表型標志蛋白OPN的表達則明顯增加。細胞學實驗結果與之相符，說明CMV感染可以促進平滑肌細胞發生表型轉化。

VSMC表型轉化受多重因素的調控，PI3K/Akt信號通路是調節VSMC表型轉化的主要信號通路。在本實驗中，PI3K/Akt信號通路的阻斷劑LY294002可以顯著阻斷MCMV感染誘導的SM22a蛋白表達的下調，以及Akt蛋白的磷酸化，而對照組無明顯變化。有文獻報道，PI3K/Akt信號通路的下游產物FoxO通過與促VSMC表型轉化的轉錄激活因子Myocardin的協同作用來調控表型轉化標志基因的表達[7]。之前的研究發現CMV通過編碼miR-217下調FoxO3a蛋白的表達，使血管內皮細胞增殖、遷移能力明顯增強[8]。近期的研究還發現，Myocardin的轉錄活性能被 CMV所增強，促使VSMC發生表型轉化[9]，這也為進一步探討CMV誘導的平滑肌細胞表型轉化的作用機制提供了思路。

總之，CMV感染可以促使平滑肌細胞發生表型轉化，PI3K/Akt信號通路是其作用途徑，但其詳細的作用機制，目前還遠未明確。

利益沖突 無