腎素—血管緊張素系統RAS在慢性應激狀態下胰島素分泌中的作用

鄒雨桐　張智博　宋佩

[摘要] 目的 研究腎素-血管緊張素系統（RAS）在慢性應激誘導下的大鼠胰島素分泌中所起作用。 方法 將20只SD大鼠隨機分為4組，正常對照、電擊組、卡托普利（captopril）處理加電擊、坎地沙坦（candesartan）處理加電擊。3個需要電擊處理組連續電擊4周，4組大鼠定期測量血壓，在電擊結束后行腹腔注射葡萄糖耐量（IPGTT）實驗，在相應的時間點測定大鼠血糖水平，處死后收集血清和胰臟，測定血清中血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）和胰島素水平，用Q-PCR測定各組大鼠的Pcsk1基因和Pcsk2基因的表達情況。 結果 在慢性應激情況下，只經電擊處理的大鼠血壓和血清血管緊張素Ⅱ水平均高于對照組大鼠的正常水平（P<0.05）；分別經過血管緊張素Ⅱ受體（AT1）拮抗劑-坎地沙坦（candesartan）和血管緊張素轉化酶抑制劑-卡托普利（captopril）處理的兩個組，大鼠的血壓及Ang Ⅱ水平均低于對照組水平（P<0.05）。3組電擊處理過的大鼠血清胰島素水平均明顯低于對照組（P<0.05）。電擊4周后的IPGTT顯示，4組大鼠的糖耐量水平表現無顯著差異。3個電擊處理組大鼠Pcsk1基因的表達相比對照組明顯降低（P<0.05），各組大鼠Pcsk2基因表達無明顯差異。 結論 在慢性應激4周的情況下，大鼠胰島素分泌出現顯著下降，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）處理并未改善慢性應激誘導引起的胰島素分泌下降，因此，RAS系統可能未參與慢性應激誘導的胰島素分泌下降。

[關鍵詞] 腎素-血管緊張素系統（RAS）；應激；胰島素；糖尿病

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）20-0036-05

The role of renin-angiotensin system（RAS） in insulin secretion under chronic stress

ZOU Yutong1 ZHANG Zhibo1 SONG Pei1 XU Qun1 ZHANG Guoxing2

1.The First School of Clinical Medicine， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China； 2.Faculty of Physiology， School of Basic Medicine and Life Sciences， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China

[Abstract] Objective To study the role of renin-angiotensin system（RAS） in the insulin secretion of rats induced by chronic stress. Methods 20 SD rats were randomly divided into 4 groups： a normal control group， a shock group， captopril treatment plus electric shock， and candesartan treatment plus electric shock. Three groups which needed electric shocks were given electric shock for 4 weeks consecutively. Four groups of rats were regularly given measurement of blood pressure. At the end of the shock， an intraperitoneal glucose tolerance test（IPGTT） was performed. The rats' blood glucose levels were measured at the corresponding time points. Serum and pancreas were collected after sacrifice. The serum angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ） and insulin levels were measured， and the expression of Pcsk1 gene and Pcsk2 gene in each group of rats was determined by Q-PCR. Results Under chronic stress conditions， the blood pressure and serum angiotensin Ⅱ levels in rats treated with electroshock were higher than the normal levels in the rats from the control group（P<0.05）； in group treated with angiotensin Ⅱ receptor（AT1） antagonists-candesartan and angiotensin converting enzyme inhibitor-captopril respectively， the blood pressure and Ang Ⅱ levels in rats were lower than those in the control group（P<0.05）. The serum insulin levels in rats treated with electroshock in the three groups were significantly lower than those in the control group（P<0.05）. IPGTT after 4 weeks of electroshock showed no significant difference in glucose tolerance levels between the four groups. Compared with the control group， the expression of Pcsk1 gene in the three electroshock groups was significantly lower（P<0.05）. There was no significant difference in the expression of Pcsk2 gene between all groups. Conclusion In the case of chronic stress for 4 weeks， insulin secretion is significantly reduced in rats. Treatment with captopril and candesartan do not improve the reduction of insulin secretion induced by chronic stress induction. Therefore， RAS system may not be involved in the chronic stress-induced decrease in insulin secretion.

[Key words] Renin-angiotensin system（RAS）； Stress； Insulin； Diabetes

近40年來，我國經濟社會發展迅猛，人口老齡化趨勢明顯，糖尿病等多發生于老年人群的代謝性疾病發病率呈現出顯著增高的趨勢，當前我國統計的數據顯示，國內現有15.5%患有糖尿病[1]。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為一種臨床常見的糖尿病類型，是以胰島 B細胞功能缺陷和胰島素抵抗為主要病理生理改變的代謝性疾病，目前認為由遺傳和環境因素互相作用引起。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島 B細胞功能缺陷在糖尿病的發展過程中扮演重要角色[2]。胰島素抵抗是機體對一定量或濃度的胰島素的生物效應減低，主要指機體由胰島素介導的葡萄糖攝取和代謝能力減弱，包括胰島素的敏感性下降和反應性下降[3]。有關T2DM胰島素抵抗的發生機制比較復雜，一直是研究的熱點。本文將討論慢性應激引起的胰島素分泌不足及RAS系統在其中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗采用20只SD大鼠，蘇州大學醫學部實驗動物中心提供[許可證號：SYXK（蘇）2017-0043]，均為雄性，體重200～250 g，喂養條件如下：5只一籠，室溫25℃，濕度50%～60%，通風良好，自由攝食、飲水，常規日夜周期環境下實驗室飼養。

實驗所用藥物為血管緊張素Ⅱ受體1阻斷劑坎地沙坦（candesartan）（成都艾科達化學試劑有限公司，AR，99.0%，1g，CAS：145040-37-5）及血管緊張素Ⅰ轉換酶抑制劑卡托普利（captopril）[東京化成工業株式會社，>98.0%（HPLC）（T），CAS：62571-86-2]，將藥物溶解即可使用。

1.2 實驗動物處理

將SD大鼠隨機平均分為4組（n=5）：對照組、電擊組、卡托普利（captopril）處理加電擊組、坎地沙坦（candesartan）處理加電擊組。藥物處理組每天上午給藥（劑量為卡托普利100 mg/kg，坎地沙坦10 mg/kg），三個電擊處理組每天上午和下午電擊，一次持續2 h，共電擊4周，期間定期測量大鼠血壓。電擊的最后1 d，電擊完成后禁食，取血清第2天進行IPGTT試驗，隨后處死大鼠，取胰腺進行后續指標的測定。

1.3 觀察指標

（1）血壓測定：每7天采用尾袖法通過無創血壓儀測定清醒安靜狀態下的各組大鼠尾動脈的收縮壓和心率。測量血壓前將大鼠預置于37℃的恒溫箱中，持續10～20 min，使其尾部動脈擴張便于測量。在動物適應環境、行為穩定后，開始測量，連續測3次，取其均值。（2）IPGTT：在腹腔注射葡萄糖前和腹腔注射葡萄糖后的10 min、15 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min的時間點測量血糖。（3）血清：使用試劑盒測定大鼠血清中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和胰島素的含量。（4）Q-PCR：研磨和勻漿樣品，提取總mRNA，以mRNA為模板，采用Oligo隨機引物，利用逆轉錄酶反轉錄生成cDNA。再以cDNA作為模板配制PCR反應體系，放入實時熒光定量PCR儀中，設定好程序后開始反應，記錄CT值。具體步驟如下：以mRNA為模板經逆轉錄合成cDNA，每個反應體系共20 μL，SYBR Premix EX Taq Ⅱ（Tli RNasH Plus）（2×） 10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，RT反應液（cDNA溶液）2 μL，ddH2O 6 μL。將準備好的96孔板置于實時熒光定量PCR儀中，設定好程序后開始反應。本實驗的反應條件為：（1）預變性階段：95℃ 2 min，1 cycle。（2）熱循環階段：95℃ 15 sec，60℃ 1 min，40 cycle。（3）溶解曲線：95℃ 15 sec，60℃ 15 sec，95℃ 15 sec，1 cycle。各基因引物如下。見表1。

1.4 統計學方法

用SPSS17.0 for Windows 統計軟件，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗比較組內差異，檢驗組間差異進行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血壓情況

從第7天開始，對照組和電擊組血壓有明顯差異，第7天（t=3.138，P<0.05）、第14天（t=6.975，P<0.05）、第21天（t=11.879，P<0.05）和第28天（t=39.500，P<0.05）電擊組血壓均高于對照組。第7天開始，卡托普利處理加電擊組血壓明顯低于電擊組（t=4.808，P=0.01<0.05），此后第14天（t=5.769，P<0.05）、第21天（t=19.269，P<0.05）、第28天（t=7.538，P<0.05）卡托普利處理加電擊組血壓均低于電擊組。

第7天開始，坎地沙坦處理加電擊組血壓明顯低于電擊組（t=7.931，P<0.05），此后第14天（t=8.406，P<0.05）、第21天（t=12.612，P<0.05）、第28天（t=46.040，P<0.05）坎地沙坦處理加電擊組血壓均低于電擊組。

以上結果表明電擊組導致大鼠血壓升高，卡托普利和坎地沙坦有降血壓的作用。見圖1及表2。

2.2 大鼠血清Ang Ⅱ情況

比較各組大鼠血清Ang Ⅱ情況，與對照組大鼠血清Ang Ⅱ（5.39±0.51 ng/mL）相比，電擊組大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）顯著升高（t=3.569，P<0.05），與電擊組大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）相比，卡托普利處理加電擊組（2.10±0.32 ng/mL）（t=7.752，P<0.05）及坎地沙坦處理加電擊組（2.73±0.44 ng/mL）（t=6.633，P<0.05）顯著降低，可見兩藥物阻斷RAS系統而且效果明顯。見圖2。

2.3 IPGTT各組血糖情況

在注射葡萄糖溶液之前測血糖發現對照組高于電擊組（t=3.000，P<0.05），卡托普利處理加電擊組與電擊組無明顯差異，坎地沙坦處理加電擊組血糖值比電擊組高（t=7.608，P<0.05）。

在腹腔注射葡萄糖后，各組血糖在15 min達到峰值，峰值時坎地沙坦處理加電擊組高于電擊組，高于卡托普利處理加電擊組，對照組最低，電擊組血糖水平顯著高于對照組（t=2.530，P<0.05）。隨后血糖下降的過程，對照組下降較慢，卡托普利處理加電擊組下降較快。60 min時，對照組血糖水平顯著高于電擊組（t=3.968，P<0.05），卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=2.601，P<0.05），坎地沙坦處理加電擊組與電擊組無明顯差異。90 min時，對照組血糖水平顯著高于電擊組（t=2.640，P<0.05），卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=3.833，P<0.05）。120 min時，對照組血糖水平和電擊組無明顯差異，卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=3.503，P<0.05）。見圖3及表3。

2.4 大鼠血清胰島素情況

比較各組大鼠血清胰島素水平，相比于對照組（9.15±0.22 μg/L），電擊組（6.83±0.28 μg/L）（t=6.526，P<0.05）、卡托普利處理加電擊組（6.28±0.74 μg/L）（t=3.746，P<0.05）和坎地沙坦處理加電擊組（6.47±0.58 μg/L）（t=4.360，P<0.05）血清胰島素水平均明顯低于對照組。見圖4。

2.5 大鼠Pcsk1和Pcsk2基因表達情況

比較各組大鼠Pcsk1基因的表達情況，相比對照組（1.23±0.09），電擊組（0.98±0.06）（t=3.754，P<0.05）、卡托普利處理加電擊組（0.92±0.06）（t=4.421，P<0.05）及坎地沙坦處理加電擊組（0.84±0.07）（t=5.390，P<0.05）三組Pcsk1表達明顯降低，各組大鼠Pcsk2基因表達無明顯差異。見圖5。

3 討論

關于糖尿病發病的兩種機制，胰島素抵抗和胰島B細胞功能障礙均可以導致血糖水平升高，胰島B細胞的功能障礙可引起高血糖，而高血糖又加重胰島B細胞的功能障礙[4]。胰島B細胞功能障礙在糖尿病早期是可逆的，因此在疾病早期需通過及時控制血糖水平、保護胰島B細胞功能，使胰島B細胞功能得到最大程度的恢復[5]。但隨著疾病的進展，由于細胞凋亡等原因導致胰島B細胞總量減少，直至其功能損害無法逆轉[6]。

慢性應激（Unpredictable chronic mild stress）長期以來被用于動物實驗來制造抑郁導致的身體機能紊亂的模型，是一種可靠的模擬方法，其中就包括胰島素分泌異常，而且有調查顯示這種應激會引起抑郁進而增加個體患糖尿病的可能性[7，8]。另外有研究顯示慢性應激會影響胰島素分泌和導致糖耐量異常，而且會影響胰腺上葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter-2，GLU2）的水平，導致胰島素抵抗[9，10]。

血管緊張素Ⅱ受體1阻斷劑坎地沙坦（candesartan）和血管緊張素Ⅰ轉換酶抑制劑卡托普利（captopril）是常用的降血壓藥物。有研究顯示AngⅡ具有調節胰島素的生物學功能[11]，因為AngⅡ和胰島素有一段共同的信號轉導途徑，AngⅡ激活AT1受體抑制胰島素通過PI3K途徑介導的葡萄糖的轉運、糖元合成等，可見RAS系統可以影響胰島素代謝[12]。Shiuchi等[13]研究發現ACEI使2型糖尿病小鼠骨骼肌細胞的2-去氧葡萄糖的攝取能力增加，另外有研究顯示ARB類藥物有改善胰島素調節的作用[14]。在臨床試驗方面有卡托普利預防實驗（Captopril prevention project，CAPPP）觀察到卡托普利控制高血壓的病人中新的2型糖尿病發病率低[15]，LIFE（Losartan intervention for endpoint reduction in hypertension study，2002）實驗發現氯沙坦使新發糖尿病發生率降低[16]，可見ARB及ACEI類藥物一定程度上可以改善胰島素代謝以及減少糖尿病的發生。

本研究顯示，慢性應激使大鼠出現胰島素分泌不足的情況，RAS系統未參與此過程。實驗使用無規律電擊的方法來模擬慢性應激，經過4周的電擊，電擊處理組的大鼠出現血清胰島素下降的情況，提示長時間應激導致胰島素分泌水平下降。有研究發現，應激狀態下的神經內分泌反應主要是下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活，機體通過腺垂體釋放促腎上腺皮質激素，導致兒茶酚胺類物質分泌增多[17]。兒茶酚胺動員機體的脂肪、肝糖元和肌糖元，使胰高血糖素分泌增加，促進糖元分解，同時又抑制胰島素的分泌。此外，長期電擊可能導致內質網腔內未折疊或錯誤折疊蛋白質發生堆積或鈣離子平衡發生紊亂，內質網分子伴侶Bip（immunoglobulin binding protein）解離出來與未折疊蛋白或者錯誤結合蛋白結合，使得由肌醇依賴酶IRE-1，活化轉錄因子ATF6和RNA 依賴的蛋白激酶樣激酶PERK參與的信號轉導系統被激活，從而導致內質網應激（endoplasmic recticulum stres）的發生[18，19]。胰島素從內質網開始合成，胰島素原在此正確折疊，然后運輸至高爾基體經過進一步的加工，形成成熟的胰島素來發揮作用。錯誤折疊的胰島素原等蛋白質在內質網中蓄積，通過 PERK介導的 elF2磷酸化和轉錄誘導ATF4及凋亡基因 CHOP的表達導致胰島B細胞死亡[20]。以上可能是胰島素分泌不足的機制。Pcsk1基因編碼的前蛋白轉化酶（Proprotein eonvertase 1，PC1）是胰島素源轉化為胰島素的一個重要關鍵酶，通過熒光定量PCR檢測到電擊處理組的Pcsk1基因表達明顯降低，進一步證明慢性應激影響導致胰島素分泌水平下降。

分析大鼠血壓和血清AngⅡ水平發現，電擊導致大鼠的血壓升高及血清AngⅡ水平的升高，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）成功阻斷了RAS系統導致兩給藥組的AngⅡ水平及血壓的降低，但是兩給藥組的Pcsk1基因表達水平與單純電擊組無明顯差異，而且兩給藥組的血清胰島素水平與單純電擊組也無明顯差異，提示阻斷RAS系統并未改善慢性應激誘導引起的胰島素分泌不足。另外分析IPGTT實驗情況，各組血糖在15 min時達到峰值，峰值時坎地沙坦處理加電擊組高于電擊組，高于卡托普利處理加電擊組，在血糖恢復的過程，卡普托利組恢復好于電擊組，坎地沙坦處理組與單純電擊組無明顯差異，對照組恢復情況最差，提示阻斷RAS系統并未改善胰島素分泌不足的情況，各組大鼠未出現糖尿病的表現。

綜上所述，在慢性應激誘導4周情況下，阻斷RAS系統不能改善慢性應激導致的胰島素分泌不足。本實驗對大鼠進行慢性應激的時間為4周，導致大鼠出現胰島素分泌不足情況，但是因為慢性應激時間較短，大鼠處于一種可代償的狀態，而未出現糖尿病癥狀。

[參考文獻]

[1] 馬靜靜，高鵬霞，張紅，等.細胞因子與胰島素抵抗研究新進展[J].中國老年學雜志，2015，35（17）：5032-5034.

[2] 陳宇，王立偉，李玲，等.妊娠糖尿病患者分娩后胰島素抵抗和胰島B細胞功能研究[J].中國實用內科雜志，2011，31 （1）：42-44.

[3] Himsworth HP. Diabetes mellitus： Its differentiation into insulin-sensitive and insulin-insensitive types[J]. International Journal of Epidemiology，2013，42（6）：1594-1598.

[4] 馬海林，朱筠.2型糖尿病人群胰島素抵抗及胰島B細胞功能缺陷的評估[J].中國醫學前沿雜志（電子版），2016，8（11）：88-92.

[5] 黃帥，葉山東，陳燕.新診斷2型糖尿病患者胰島β細胞功能相關因素的研究[J].中國糖尿病雜志，2015，23（1）：32-36.

[6] 凌云志，葉山東.2型糖尿病胰島B細胞功能損傷的機制[J].國外醫學（老年醫學分冊），2009，30（6）：262-266.

[7] Deng XY，Xue JS，Li HY，et al. Geraniol produces antidepressant-like effects in a chronic unpredictable mild stress mice model[J]. Physiology & Behavior，2015，152（Pt A）：264-271.

[8] Anderson RJ，Freedland KE，Clouse RE，et al. The prevalence of comorbid depression in adults with diabetes：A meta-analysis[J]. Diabetes Care，2001，24（6）：1069.

[9] Sadeghimahalli F，Karbaschi R，Zardooz H，et al. Effect of early life stress on pancreatic isolated islets insulin secretion in young adult male rats subjected to chronic stress[J]. Endocrine，2015， 48（2）：493-503.

[10] Su Q，Tao W，Wang H，et al. Umbelliferone attenuates unpredictable chronic mild stress induced-insulin resistance in rats[J]. Iubmb Life，2016，68（5）：403-409.

[11] Velloso LA，Folli F，Sun XJ，et al. Cross-talk between the insulin and angiotensin signaling systems[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，107（2）：133-139.

[12] 周亦秋，楊國君. RAS與胰島素抵抗——代謝綜合征新的治療靶點[J]. 心血管病學進展， 2006，27（6）：753-755.

[13] Shiuchi T，Cui TX，Wu L，et al. ACE inhibitor improves insulin resistance in diabetic mouse via bradykinin and NO[J]. Hypertension，2002，40（3）：329-334.

[14] Katovich MJ，Iyer SN. Effect of acute and chronic losartan treatment on glucose tolerance and insulin sensitivity in fructose-fed rats[J]. American Journal of Hypertension，1996，9（7）：662.

[15] Scheen AJ.CAPPP trial. Captopril Prevention Project[J]. Lancet，1999，353（9166）：1795-1796.

[16] Lajos M，Kórház SJ. LIFE-diabetes（Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study in patients with diabetes）[J]. European Journal of Pharmacology，1998，114（2）：239-240.

[17] 楊成君，王燦，尹忠偉，等. 冷暴露對大鼠機體能量代謝影響[J]. 中國公共衛生，2007，23（12）：1469-1470.

[18] Liu H，Cao MM，Wang Y，et al. Endoplasmic reticulum stress is involved in the connection between inflammation and autophagy in type 2 diabetes[J]. General& Comparative Endocrinology， 2015，210（2）：124.

[19] Ni M，Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases[J]. Febs Letters，2007，581（19）：3641.

[20] Teodoromorrison T，Schuiki I，Zhang L，et al. GRP78 overproduction in pancreatic beta cells protects against high-fat-diet-induced diabetes in mice[J]. Diabetologia，2013，56（5）：1057-1067.

（收稿日期：2018-04-13）