鹽酸法舒地爾對動脈瘤性蛛網膜下腔出血介入栓塞術后Rho—激酶調控與腦血管痙攣的關系研究

余丹楓　周格知　童民鋒

[摘要] 目的 研究鹽酸法舒地爾對于動脈瘤性蛛網膜下腔出血（aSAH）患者介入栓塞治療后Rho-激酶的調控及腦血管痙攣的預防作用。 方法 收錄我院于2010年6月～2016年5月aSAH患者43例，均行介入栓塞治療處理動脈瘤，術后分別應用鹽酸法舒地爾或尼莫地平進行SAH后腦血管痙攣的預防治療，測定不同時間段腦脊液Rho-激酶mRNA含量及相應時間段大腦中動脈平均流速，分析鹽酸法舒地爾對于不同病程aSAH后Rho-激酶的調控和對腦血管痙攣的預防作用。 結果 鹽酸法舒地爾組及尼莫地平組在治療14 d后GCS評分均有顯著改善，兩組病例Rho-激酶在SAH后1周內均逐漸升高，在第2周下降，相比尼莫地平組，鹽酸法舒地爾組在第3、7和14天Rho-激酶的濃度更低（P<0.05），且在相同時間點，鹽酸法舒地爾組能夠更有效降低大腦中動脈流速（P<0.05）。 結論 Rho-激酶在aSAH后1周內逐漸升高，在第2周下降，鹽酸法舒地爾能夠有效的抑制aSAH后Rho-激酶的表達，降低Rho-激酶在腦脊液中的濃度，從而降低相應時間段的大腦中動脈平均流速，其對腦血管痙攣的預防效果優于尼莫地平。

[關鍵詞] 動脈瘤性蛛網膜下腔出血；介入栓塞；Rho-激酶；腦血管痙攣；鹽酸法舒地爾；尼莫地平

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）20-0013-05

Study on regulation of fasudil hydrochloride in Rho-kinase after interventional embolization of aneurysm subarachnoid hemorrhage and its relationship with cerebral vasospasm

YU Danfeng ZHOU Gezhi TONG Minfeng CHEN Junliang LI Zhengyang YU Kaijie YUAN Jianlie

Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To study the regulation of fasudil hydrochloride on Rho-kinase after interventional embolization of aneurysm subarachnoid hemorrhage and its preventive effect on cerebral vasospasm. Methods 43 patients with aSAH in our hospital from June 2010 to May 2016 were enrolled in this study. All patients underwent embolization to treat aneurysms. Patients were treated with fasudil hydrochloride or nimodipine after surgery for the prevention and treatment of cerebral vasospasm after SAH. The levels of Rho-kinase mRNA in cerebrospinal fluid and the average velocity of middle cerebral artery were measured at different time points. The effect of fasudil hydrochloride on the regulation of Rho-kinases and the prevention on cerebral vasospasm after aSAH with different courses of disease was analyzed. Results GCS scores of fasudil hydrochloride group and nimodipine group were significantly improved after 14 days of treatment. Rho-kinases in both groups increased gradually in the first week after SAH and decreased in the second week.The concentration of Rho-kinases in fasudil hydrochloride group on day 3， 7 and 14 was lower than that of the nimodipine group（P<0.05）. At the same time point， the fasudil hydrochloride group was more effective in reduce middle cerebral artery velocity（P<0.05）. Conclusion Rho-kinases gradually increase within 1 week after aSAH and decrease at the second week. Fasudil hydrochloride can effectively inhibit the expression of Rho-kinase after aSAH and decrease the concentration of Rho-kinase in cerebrospinal fluid and thus reduce the median cerebral artery velocity at the corresponding time， which is superior to nimodipine in the prevention of cerebral vasospasm.

[Key words] Aneurysmal subarachnoid hemorrhage； Interventional embolism； Rho-kinase； Cerebrovascular spasm； Fasudil hydrochloride； Nimodipine

蛛網膜下腔出血（SAH）是神經外科常見病，根據病因可分為創傷性蛛網膜下腔出血（tSAH）和自發性蛛網膜下腔出血（sSAH）。其中動脈瘤性蛛網膜下腔出血（占70%～80%）是自發性蛛網膜下腔出血的主要病因。腦血管痙攣（CVS）是指蛛網膜下腔出血后大腦底部大容量動脈管腔的遲發性縮窄，作為蛛網膜下腔出血（SAH）最嚴重的并發癥之一，可引起彌漫性腦水腫和遲發性缺血性神經損傷，是SAH 致死和致殘的首要原因[1]。因為SAH后腦血管痙攣的嚴重性和高發生率，其始終是SAH治療中的重中之重，除了常規的3H治療，目前臨床當中最常用的藥物是尼莫地平，臨床研究證實其作為鈣離子通道阻滯劑，有緩解腦血管痙攣的作用，經顱多普勒超聲也證實其能改善SAH后腦血流[2]，但是腦血管造影并未能顯示出其明顯緩解血管痙攣的作用[3]。鹽酸法舒地爾是一種新型的鈣離子拮抗劑，目前也被廣泛應用于臨床對于SAH后腦血管痙攣的預防，不同于尼莫地平，其不僅能抑制細胞內游離鈣離子的活動，還能通過抑制Rho-激酶產生達到擴血管作用[4]。目前對于Rho-激酶抑制劑-鹽酸法舒地爾對于動脈瘤性蛛網膜下腔出血介入栓塞后不同病程Rho-激酶的調控及其對CVS的預防作用的研究較少。本研究通過術后分別應用鹽酸法舒地爾（鹽酸法舒地爾組）及尼莫地平（尼莫地平組）預防SAH后CVS的發生，通過對比兩組患者不同時間段的腦脊液Rho-激酶的含量，分析鹽酸法舒地爾對于Rho-激酶的調控作用，同時應用顱內多普勒超聲對不同時間段大腦中動脈（MCA）平均血流速度（MCA-Vm）進行測量來判斷腦血管痙攣程度，試圖說明鹽酸法舒地爾對不同病程動脈瘤性蛛網膜下腔出血后Rho-激酶調控與腦血管痙攣的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收錄我院于2010年6月～2016年5月確診動脈瘤性SAH患者共計43例，其中使用尼莫地平18例，使用鹽酸法舒地爾25例。

1.2 入組條件

納入標準：（1）頭顱CT和腦血管造影明確顱內動脈瘤破裂伴蛛網膜下腔出血；（2）行單純介入栓塞治療。排除標準：（1）Hunt-Hess分級為V級患者；（2）動脈瘤大小>2.5 cm；（3）治療期間同時使用尼莫地平及鹽酸法舒地爾；（4）術中使用支架；（5）應用抗血小板藥物；（6）應用血栓素抑制劑；（7）年齡在80歲以上患者；（8）伴有其他嚴重的器質性疾病。

1.3 治療方案

患者入院后均行常規規范化治療，單純介入栓塞處理顱內動脈瘤，術后給予高血壓、高血容量、血液稀釋的“3H”治療、止血、脫水、補液、營養神經、維持電解質平衡等對癥支持治療。尼莫地平組使用尼莫地平10 mg Q8H（拜耳仙靈醫藥保健公司 50 mL/10 mg，國藥準字J20100002）微泵靜脈維持，鹽酸法舒地爾組以鹽酸法舒地爾30 mg（天津紅日藥業股份有限公司，2 mL/30 mg，國藥準字 H20040356）鹽水稀釋后每天2次靜脈滴注，均常規使用14 d。

1.4 檢測指標

記錄并統計患者入院時的Hunt-Hess分級（蛛網膜下腔出血的臨床表現分級評分：Ⅰ級為無癥狀或輕微頭痛及輕度頸強直；Ⅱ級為中重度頭痛，頸強直，除有顱神經麻痹外，無其他神經功能缺失；Ⅲ級為倦睡，意識模糊，或輕微的灶性神經功能缺失；Ⅳ級為木僵，中或重度偏側不全麻痹，可能有早期的去腦強直及植物神經系統功能障礙）、CT-Fisher分級（蛛網膜下腔出血CT表現分級評分：Ⅰ級為無明顯蛛網膜下腔出血；Ⅱ級為廣泛蛛網膜下腔出血，無血凝塊；Ⅲ級為蛛網膜下腔有血凝塊或垂直層血腫>1 mm厚；Ⅳ級為腦內或腦室內血腫）和GCS評分（昏迷指數評分：根據患者睜眼反應、言語反應和肢體反應進行評分，輕度昏迷為13～14分，中度昏迷為9～12分，重度昏迷為3～8分），治療14 d后的GCS評分，通過留取住院病人出血后1、3、7及14 d的腦脊液，測定腦脊液中Rho-激酶mRNA的濃度，同時使用TCD診斷儀測定對應時間的MCA平均血流速度（MCA-Vm），評估腦血管痙攣情況[5，6]，通過對比兩組患者不同病程時期的相關統計數據，對Rho-激酶抑制劑-鹽酸法舒地爾對SAH后CVS的作用關系進行對比分析。

1.5 測量方法和診斷標準

1.5.1 TCD診斷儀對腦血管痙攣的測定 用2 MHz脈沖探頭通過顳窗測取雙側大腦中動脈（MCA）的平均流速（Vm），動態評價不同時期蛛網膜下腔出血后引起腦血管血流動力學變化。

1.5.2 RT-PCR方法檢測Rho-激酶mRNA的表達 腦脊液離心后去上清液，用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計檢測純度。反應分2步進行：取5 L總RNA，在M-MLV逆轉錄酶作用下合成CDNA；再取5 L逆轉錄產物進行PCR擴增反應。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外透射反射儀觀察擴增產物的大小及亮度并攝影。

1.6 統計學方法

本實驗采用統計軟件SPSS19.0進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P<0.05為有顯著差異。

2結果

2.1 不同組別aSAH整體臨床療效比較

根據患者介入栓塞術后使用藥物分為鹽酸法舒地爾組和尼莫地平組，入院時各組患者之間Hunt-Hess分級、CT-Fisher分級組成基本相同，且入院時各組患者之間GCS評分無顯著差異，在治療14 d后GCS評分均有顯著改善，兩組之間治療后GCS評分無顯著差異（表1、2）。同時鹽酸法舒地爾組對比尼莫地平組治療后GCS評分改善分數均無顯著差異（表2）。

2.2 aSAH后鹽酸法舒地爾對Rho-激酶的調控

通過檢測尼莫地平組腦脊液Rho-激酶mRNA的含量可以發現其在aSAH后1周內呈上升階段，在第2周開始下降，鹽酸法舒地爾組在第1天起始治療時腦脊液中檢測Rho-激酶mRNA的含量與尼莫地平組無明顯差異，但在后續第3天、第7天及第14天的測定中，可以發現鹽酸法舒地爾組腦脊液中Rho-激酶mRNA的含量均較尼莫地平組低，且兩組之間均存在顯著差異，說明鹽酸法舒地爾能夠很好的透過血腦屏障抑制SAH后Rho-激酶的產生（表3）。

2.3 Rho-激酶對SAH后腦血管痙攣的調控

通過TCD測定大腦中動脈的平均流速并進行分析，可見MCA-Vm在SAH后第1天處于正常水平，且兩組患者MCA-Vm在初始階段相當，無明顯差異，MCA-Vm在第3天及第7天較高，說明第3天及第7天是腦血管痙攣的高峰期，MCA-Vm在第14天恢復到基礎水平，兩種藥物均能有效的控制SAH后MCA-Vm的升高，預防腦血管痙攣的發生，其中鹽酸法舒地爾組在第3天、第7天和第14天的大腦中動脈流速較尼莫地平組有明顯改善（P<0.001）（表4）。同時結合表3可發現第3天、第7天和第14天，鹽酸法舒地爾組Rho-激酶mRNA含量較尼莫地平組均有顯著性減少，在相應時間段鹽酸法舒地爾組MCA-Vm流速較尼莫地平組也有顯著降低，可見Rho-激酶參與SAH后腦血管痙攣的發生且發揮了重要作用。由此可見兩種藥物均能有效的預防SAH后腦血管痙攣的發生，但是相對于尼莫地平，鹽酸法舒地爾可以通過降低Rho-激酶的表達取得更好的CVS預防效果（表 3、4）。

3討論

動脈瘤性蛛網膜下腔出血是致殘、致死率很高的急性出血性腦血管病。其原發病的治療主要包括開顱動脈瘤夾閉和介入治療。相比于開顱手術，介入治療創傷小、并發癥少等優勢使得其在動脈瘤的治療中越來越普遍。彈簧圈栓塞介入治療通過填塞動脈瘤腔，繼而在瘤腔內形成血栓堵塞動脈瘤腔來達到治療動脈瘤的效果。但是破裂動脈瘤引起的蛛網膜下腔出血會繼發腦血管痙攣，引起繼發的缺血性腦損傷，因此介入栓塞術后的藥物治療預防腦血管痙攣的發生同樣重要[7]。

1951年，Ecker首次通過腦血管造影證實了蛛網膜下腔出血后可以繼發彌漫性或局限性的腦血管痙攣[7]，腦血管痙攣是血管的持續收縮狀態，以意識障礙為首發體征，一旦發生，往往難于逆轉，甚至會出現局部運動及語言障礙、腦梗死等，CVS一般在SAH后 4～10 d達到高峰[8]，本次實驗在第3天及第7天時測得大腦中動脈流速最高，說明相應時間段腦血管痙攣程度最重，與文獻報道基本相仿。腦血管痙攣的診斷標準為：（1）癥狀經治療或休息好轉后出現惡化或進行性加重，伴發熱、血象升高但無感染跡象；（2）出現頭痛、嘔吐等顱內壓升高癥狀；（3）意識障礙呈波動性變化或進行性加重；（4）出現偏癱、失認、失語等神經系統定位體征；（5）DSA或CTA和MRA檢查提示CVS；（6）經顱多普勒（TCD）顯示大腦中動脈（MCA）血流速度≥120 cm/s。對符合上述標準之一或多項，排除再出血、顱內血腫、腦積水、電解質紊亂等，且癥狀發生在出血后2～21 d內。本研究主要通過TCD測定大腦中動脈的血流速度作為定量指標，評估aSAH后兩種藥物對腦血管痙攣的預防作用。

SAH后腦血管痙攣的發病機制十分復雜，累積的研究表明其是一個多因素、多步驟的復雜的病理過程，但目前研究表明其最后共同途徑是血管平滑肌細胞的鈣離子內流和細胞內鈣庫中Ca2+釋放從而導致 Ca2+超載[9]。研究和臨床實驗表明鈣離子拮抗劑可以和動脈壁的特定受體結合，從而阻斷鈣離子進入神經元細胞胞漿，避免胞內游離鈣離子升高，從而起到對腦細胞的保護作用；同時鈣離子拮抗劑還可以通過抑制血管平滑肌收縮，降低血管通透性，緩解CVS及其繼發的腦水腫。

尼莫地平為第二代雙氫吡啶類鈣離子拮抗劑，是目前脂溶性最高的鈣離子拮抗劑，此高親脂性決定了其易透過血腦屏障，在顱內達到較好的藥物濃度，同時雙氫吡啶環使其對血管平滑肌有高度選擇性[10]。尼莫地平一方面阻斷血管平滑肌細胞膜上L型電壓門控性Ca2+通道，從而抑制Ca2+內流，避免細胞內鈣離子升高過載，另一方面刺激Ca2+-ATP酶活性，既能促進胞漿內鈣的排除，也能增強線粒體、內質網等鈣庫的攝取和儲存鈣的作用，從而調節細胞內Ca2+的濃度，使之保持正常的生理功能。除了拮抗鈣離子，尼莫地平還可抑制血小板和白細胞聚集，降低紅細胞剛性和血液粘滯性，防止血小板聚集后釋放5-HT、花生四烯酸等血管活性物質，減少腦血管痙攣的發生。同時尼莫地平還可以通過抑制SAH誘導的神經細胞凋亡從而改善SAH的臨床預后[11]。

本次課題研究也證實尼莫地平對于SAH后腦血管痙攣的預防的有效性和安全性，無論是在SAH后初期、高峰期還是后期，尼莫地平均能有效地控制MCA-Vm于一個較低的水平，說明其對SAH后腦血管痙攣的預防作用還是明確的。

最近研究表明，在人和動物SAH后Rho -激酶的升高可通過不依賴Ca2+的方式參與血管平滑肌細胞異常收縮，在 CVS 的發病機制中發揮重要作用。目前的研究表明Rho-激酶與很多細胞活動有關，Rho-激酶的激活，可參與調節細胞骨架的組裝、細胞粘附、細胞移動、平滑肌收縮和基因表達[12]。SAH 后，血液中致痙攣物質可激活細胞表面受體，進而使Rho A與細胞膜上的GTP結合，激活 Rho-激酶，后者可直接磷酸化 MLC來抑制 MLCP，使其失活，從而使平滑肌對恒定的鈣離子濃度的敏感性增加，產生Ca2+敏感性，導致MLC磷酸化水平升高和平滑肌細胞收縮增強，從而導致SAH后腦血管痙攣的發生[13，14]。血紅蛋白（OxyHb）和ET-1是目前已知 SAH最明確的兩種致痙攣物質。

鹽酸法舒地爾作為目前唯一上市的Rho-激酶抑制劑，在靜脈內應用時能夠抑制Rho-激酶活性，減輕血管內膜損傷，有效防止SAH后CVS的發生[15，16]。鹽酸法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物，具有明顯的血管擴張作用。其制劑為水溶液，對光照相對穩定。鹽酸法舒地爾在人體內代謝較快，消除半衰期為16 min。其代謝產物羥基異喹啉，也具有血管舒張作用。鹽酸法舒地爾給藥后24 h以原型及代謝產物的形式由尿排泄[17]。

鹽酸法舒地爾不是單純的鈣離子拮抗劑，其不僅能抑制細胞內鈣離子活動，還能作用于蛋白激酶C、內皮素等蛋白激酶的關鍵部位，抑制血管平滑肌收縮最終階段肌球蛋白輕鏈磷酸化和自由基的產生，使已經痙攣的血管平滑肌松弛起到擴張血管的作用。同時可增加內皮細胞NO合成酶的表達，預防缺血后再灌注損傷，減少神經功能缺失，減小缺血灶體積[18]，馬景鑑等[19]臨床試驗也證實了其有效性。鹽酸法舒地爾不僅能預防SAH后CVS的發生，其還能修復缺氧導致的腦損傷和改善缺血性疾病引起的神經功能恢復[20，21]。因此其不僅能夠預防SAH后腦血管痙攣的發生，其對腦血管痙攣也有一定的治療效果。

通過本研究可以發現相對于尼莫地平，鹽酸法舒地爾作為Rho-激酶抑制劑能夠有效預防aSAH介入治療后Rho-激酶在蛛網膜下腔的生成和集聚，使其一直保持在SAH剛發生時的水平，從而緩解Rho-激酶升高促進SAH后CVS的發生。同時通過對比尼莫地平組對不同階段大腦中動脈平均流速，也證實了鹽酸法舒地爾能夠更加有效地改善aSAH后大腦中大動脈的痙攣程度，其對aSAH介入栓塞治療后CVS的發生預防效果更佳。

4結論

Rho-激酶在動脈瘤性蛛網膜下腔出血介入治療后1周內表達均逐漸升高，隨后均在第2周下降，與aSAH后CVS的高峰基本吻合，說明其參與aSAH后腦血管痙攣的發生，研究表明相對于尼莫地平，鹽酸法舒地爾能夠更有效地抑制aSAH后Rho-激酶的升高，從而能夠更有效地預防腦血管痙攣的發生。

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（收稿日期：2018-01-02）