基于PTN系統(tǒng)分析轉基因稻米油脂的非預期變異效應

趙 艷 史玉倩

(浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310018)

水稻是全球主糧作物之一，轉基因(genetically modified，GM)水稻在中國、亞洲和世界上其他地區(qū)都具有潛在重大利益和深遠影響［1］。隨著轉Bt抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”生產應用安全證書的頒發(fā)和延期獲準，有關GM水稻安全性的爭論日趨激烈。從分子生物學角度，GM作物除了外源基因編碼產物賦予的可預期特定遺傳效應外，還可能存在其他不可預期的變異效應，簡稱為非預期效應(unintended effects)。GM作物的非預期效應可能改變相關食品的營養(yǎng)品質，甚至產生對人類和動物有害的毒素。系統(tǒng)比較研究能為GM作物的非預期效應安全性評估提供重要線索［2］。1993年OECD提出GM食品風險評估的實質等同性原則。2004年OECD建議采用食品關鍵營養(yǎng)因子和抗營養(yǎng)因子對水稻新品種進行評估，營養(yǎng)因子包括氨基酸、脂肪酸、礦物質和維生素等，抗營養(yǎng)因子包括植酸、植物血凝素和胰蛋白酶抑制劑等［3］。油脂是稻米的重要成分，雖然含量不高，如糙米約為3%，精米約為0.8%，糠約為20%，但多為優(yōu)質不飽和脂肪酸或淀粉油脂復合物［4］，不僅營養(yǎng)價值高，而且與稻米的食用品質及陳化劣變密切相關。分析GM稻米油脂的非預期效應是安全性評估的重要環(huán)節(jié)。Jiao等［5］研究表明與親本相比，轉基因水稻種子的主要脂肪酸組分發(fā)生了非預期變異，其中相對含量的變異幅度為19% ～38%，其中T2的C16∶0降低21%。Choi等［6］發(fā)現與對照相比，轉 bar基因稻米主要脂肪酸組分未發(fā)生顯著改變，只有稻米油脂中占比極低的C14∶0和C16∶1在含量上發(fā)生了顯著變異。Nam等［7］報道耐旱轉基因稻米和非轉基因對照相比，硬脂酸(C18∶0)和鱈油酸(C20∶1)的含量增加。但Wang等［2］發(fā)現轉Cry1ab/ac基因水稻種子與非轉基因對照油脂含量和脂肪酸組分及含量均沒有顯著差異。前人研究僅采用非轉基因親本作為單一對照樣本，即使GM作物品系產生了與親本不等同的非預期變異，也無法確認這種非預期效應是由轉基因技術引發(fā)的。基于此，我們課題組首次提出了GM農作物安全性評價的PTN(parent control－transgenic plant－nontransgenic control)系統(tǒng)觀念并用于GM水稻種子蛋白質組分的非預期變異分析，即對轉基因品系T(transgenic line)依據“實質等同性”原則進行評價時，對照樣本中除了常規(guī)親本P(parent line)外，增加遺傳學背景相關的非轉基因組培再生株系NR(non－transgenic regenerated line)和非轉基因遺傳分離陰性后代株系NS(non－transgenic segregated negative offspring line)等遺傳學對照樣本，經過樣本間的多重比對分析，能解析GM品系非預期效應的技術來源并客觀評價其安全性［8］。本研究以抗草甘膦GM水稻為材料，根據PTN系統(tǒng)分析GM稻米油脂含量和脂肪酸組成的非預期效應，為GM水稻的安全性評價提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

親本材料:粳稻品種日本晴(P1)和PJ574(P2)由中國水稻研究所種質創(chuàng)新課題組提供。轉2mG2－epsps基因抗草甘膦純合株系T13和T22:分別以P1和P2的成熟胚愈傷組織為受體，利用基因槍介導潔凈DNA轉化法將目的基因2mG2－epsps表達框(包括CaMV35S啟動子、2mG2－epsps編碼區(qū)、nos終止子)［9］導入水稻獲得;T13相應的非轉基因組培株系對照NR13和非轉基因陰性分離株系NS13，T22相應的對照株系NR22和NS22來源描述參見前期論文［8］。所有水稻材料于12月種植于海南轉基因實驗田，次年收獲，水稻種子自然曬干后保存于4℃冰箱備用。

1.2 稻米油脂的提取和定量測定

水稻種子脫殼后磨粉過80目篩，稻米油脂提取按參考文獻［10］。準確稱取米粉m1(g)到離心管，按料液比1∶3加入正己烷，搖勻振蕩，40℃水浴鍋中浸提15 min，中間顛倒混勻3次。8 000 r/min離心10 min收集上清，重復提取兩次合并上清，在真空濃縮儀中40℃去除溶劑，干燥2 h至恒重，得油脂稱質量m2(g)，置4℃冰箱備用。

油脂含量=m2/m1×100%

油脂含量變異幅度=(水稻樣本T/NR/NS油脂含量－親本P油脂含量)/親本P油脂含量×100%

1.3 稻米脂肪酸組分及含量分析

參照文獻［11－12］進行脂肪酸甲酯化。將稻米油脂提取物溶于0.2 mL氯仿:甲醇(2∶1)，加0.3 mL鹽酸甲醇溶液(5%，V/V)，85℃靜置1 h。冷卻至室溫后加1mL正己烷提取2 h，吸取上清進行氣相色譜－質譜(GC－MS)分析。采用Agilent 7890A－5975C氣相色譜－質譜儀，FID檢測器，HP－INNOWAX毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)。載氣為高純度He，恒壓模式，壓力為2.047 6 psi;進樣口溫度為250℃，進樣量1μL，分流比為20∶1。升溫程序:50℃保留1 min，以25℃/min升至200℃，再以3℃/min升溫至230℃，保持23 min。EM電壓為2 094eV，質量數掃描范圍:33～500 amu，離子源溫度為230℃。四級桿溫度為150℃。質譜峰識別是利用NIST laboratory標準譜庫檢索和基于標樣(FAME Mix，C4－C24)出峰保留時間，并根據人工譜圖解析，確定脂肪酸組成，以面積歸一化法計算各組分的相對含量。

脂肪酸相對含量變異幅度=(水稻樣本T/NR/NS脂肪酸相對含量－親本P脂肪酸相對含量)/親本P脂肪酸相對含量×100%

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

每個樣品設3次重復，結果以X±s(平均數±標準誤差)表示。分別以P1和P2為對照，應用Origin軟件對其他樣本(T、NR、NS)數據進行單因素方差分析和多重比較分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

采用雙倍單邊檢驗(two one－sided tests，TOST)程序［13－14］對樣本間差異進行實質等同性判斷。2個樣本之間置信區(qū)間取90%，即100(1－2×α)%，顯著水平α=0.05，被認為2個樣本存在顯著差異。等同性邊界根據北歐部長理事會推薦標準定義為平均數±20%，變異幅度超過20%即判斷為不等同。

2 結果

2.1 GM水稻及其多重對照樣本的稻米油脂含量變異分析

T13和T22兩個GM株系及其相應對照樣本的糙米油脂含量比較結果見表1。所試糙米油脂含量范圍為2.06% ～3.35%，親本品種P2比P1降低了38.51%，差異極顯著，根據TOST判定二者不等同，說明天然品種差異影響水稻糙米油脂含量。T13和T22的糙米油脂含量與相應親本差異極顯著，均不等同，T13比P1降低了21.79%，T22比親本P2增加了20.87%。

表1 轉基因水稻與其多重對照樣本糙米油脂含量變異分析

在相同遺傳世代和種植環(huán)境下，GM水稻非預期效應的技術來源主要包括組織培養(yǎng)無性系變異和外源基因插入突變。NS對照株系在轉基因過程中經歷的了如下過程:2mG2－epsps基因導入細胞"2mG2－epsps在姐妹同源染色體整合"草甘膦抗性篩選和植株再生"轉基因姐妹染色體的孟德爾遺傳分離"NS株系獲得。該過程中受體細胞經歷了外源基因的導入和分離逸出事件，簡稱為轉基因穿梭，與轉基因過程密切相關。因此，NS非預期效應的技術來源包括組織培養(yǎng)無性系變異效應和轉基因穿梭效應;NR對照株系的非預期變異主要由組織培養(yǎng)無性系變異效應引起，組織培養(yǎng)技術被認為是安全的常規(guī)育種技術，其無性系變異效應無需評估。根據PTN系統(tǒng)樣本間的多重比較信息(表2)解析GM水稻非預期效應的技術來源，發(fā)現T22的油脂含量改變趨勢與NR22一致，而且 NR22的油脂含量變異幅度(40.29%)比T22(20.87%)要大，說明 T22油脂含量變異主要來源于轉基因過程中的組織培養(yǎng)無性系變異效應，受外源基因插入突變的影響較小。T13的組培對照株系NR13和親本P2相比油脂含量差異不顯著，說明T13的油脂含量變異可能主要來源于轉基因插入突變效應。

2.2 GM稻米脂肪酸組成的變異分析

由于樣品量多，僅將GM水稻T13株系和其親本P1的糙米脂肪酸檢測氣相色譜－質譜圖示于圖1。由圖1可知2個樣本的脂肪酸組分相同，都包括12個脂肪酸峰，不同樣本出峰時間在誤差范圍內。GM株系T13和非轉基因多重對照樣本P1、NR13、NS13相比，糙米脂肪酸組分沒有改變，只是脂肪酸組分的圖譜峰值不完全一致，說明有些組分相對含量存在差異，T22及其對照樣本的分析結果與此類似。

2.3 GM水稻糙米脂肪酸組分相對含量的變異及技術來源分析

分別以P1和P2為對照，對各樣本脂肪酸組分的相對含量進行統(tǒng)計分析，結果匯總于表2和表4，并將各PTN系統(tǒng)實驗樣本的脂肪酸含量變異趨勢和變異幅度及實質等同性判定結果分別匯總于表3和表5。表2和表4結果表明，GM水稻株系與其相應的多重對照樣本的脂肪酸組成相同，主要脂肪酸組分為棕櫚酸、油酸和亞油酸，且不飽和脂肪酸含量占70%以上，只是部分脂肪酸相對含量發(fā)生了顯著變異。T13有4種脂肪酸的相對含量與P1差異顯著，而NR13和更為嚴謹的遺傳學對照樣本NS13分別有5種和7種脂肪酸相對含量與P1差異顯著(表2)，說明糙米脂肪酸組分相對含量的變異效應可能受組織培養(yǎng)的影響較大。其次，T13中營養(yǎng)價值較高的不飽和脂肪酸含量比P1顯著增加，而NR13的不飽和脂肪酸含量顯著降低，可見非預期變異效應也可能改善稻米營養(yǎng)品質。

圖1 轉基因水稻株系T13與其親本P1糙米脂肪酸氣相色譜－質譜圖

表2 轉基因水稻T13與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量變異分析/%

表3 轉基因水稻T13與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量(%)的變異幅度及實質等同性分析

表3結果可知，在12種脂肪酸中，按照TOST標準，T13只有亞麻酸的相對含量比 P1增加了23.75%，與P1不等同，而組培對照株系NR13的亞麻酸相對含量的變異幅度(53.20%)更大;T13油酸相對含量比親本P1顯著降低，且變異趨勢與NR13一致，只是NR13的降低幅度(7.08%)顯著大于T13(3.68%)，表明GM株系T13的亞麻酸和油酸相對含量的變異可能主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應。同理，可以推測T13的亞油酸和硬脂酸相對含量變異受外源基因插入突變效應的影響較大。

由表4可知，T22糙米有10種脂肪酸相對含量與P2差異顯著，NR22和NS22分別也有10種和9種脂肪酸相對含量與P2差異顯著且變異脂肪酸種類基本相同，說明T22糙米脂肪酸相對含量變異主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應。就不飽和脂肪酸相對含量而言，T22比P2顯著增加，NR22與P2相似，而NS22也比P2顯著增加，說明轉基因過程的穿梭效應對提高T22不飽和脂肪酸含量的貢獻較大，組織培養(yǎng)無性系變異效應的影響較小。

表5顯示T22糙米脂肪酸組分相對含量的變異情況及其與P2的實質等同性分析結果。在8種不等同組分中，T22花生酸相對含量變異幅度最大。根據多重對照樣本分析其變異效應來源可知，T22的花生酸相對含量比P2增加了約3倍，變異幅度與NS22相似，卻顯著高于NR22(增幅1.84倍)，可見T22花生酸含量變異主要受轉基因過程的穿梭效應和組織培養(yǎng)無性系變異效應的雙重影響，受轉基因插入突變效應影響很小。同理，T22的棕櫚油酸、油酸、鱈油酸的含量變異效應來源與花生酸相似。T22的硬脂酸、亞麻酸和二十二碳烷酸的相對含量與NR22、NS22對照品系之間差異不顯著，變異方向也完全一致，說明其主要來源于組織培養(yǎng)無性系變異效應，幾乎不受轉基因插入效應和轉基因穿梭效應影響。T22的芥酸相對含量與P2實質不等同，然而對照株系NR22和NS22的芥酸含量與P2無顯著差異，由此可推斷該變異主要由轉基因插入突變效應引發(fā)。

表4 轉基因水稻T22與其多重對照樣本糙米脂肪酸組分相對含量變異分析/%

表5 轉基因水稻T22與其多重對照樣本糙米脂肪酸含量(%)變異幅度及實質等同性分析

表6 兩親本品種稻米脂肪酸組分含量(%)的差異比較和實質等同性分析

2.4 GM水稻糙米脂肪酸組分相對含量變異的安全性評價

兩粳稻親本品種P1和P2的脂肪酸相對含量差異反映水稻天然品系之間的差異，以P1為對照，將P2脂肪酸組分相對含量的變異趨勢和幅度匯總于表6，并根據TOST判斷其與P1的實質等同性。在12種脂肪酸組分中，有6種脂肪酸組分在P1和P2之間不等同，其中花生酸的含量差異幅度最大，P2比P1降低65.23%。

參照P1和P2之間的差異情況和非預期效應的技術來源追溯結果，可分析GM稻米脂肪酸組分非預期變異的安全性。綜合而言，T13只有亞麻酸的相對含量比P1增加23.75%，低于P1和P2兩親本之間的差異幅度62.87%，說明轉基因技術對GM稻米脂肪酸含量的變異效應小于水稻品種天然基因型差異。T22株系8種不等同組分中，亞麻酸相對含量的變異幅度(27.50%)低于P1和P2兩親本之間的差異幅度62.87%，棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、二十二碳烷酸的相對含量變異幅度(23.07% ～56.00%)雖然高于P1和P2之間的差異幅度(12.25%～29.36%)，但仍低于P1和P2兩親本脂肪酸組分相對含量的最大差異幅度65.23%，說明這5種脂肪酸相對含量的變異幅度在安全范圍之內。然而T22的其余3種不等同脂肪酸組分的變異安全性值得進一步評估，原因在于:花生酸和鱈油酸相對含量的變異幅度(分別為303.34%和124.41%)遠超出P1和P2之間的最大差異幅度65.23%，且基于PTN系統(tǒng)分析知其變異效應包括轉基因過程的穿梭效應;芥酸的相對含量變異幅度雖然低于65.23%，但變異效應主要來自轉基因插入突變效應。

3 討論與結論

“實質等同性”原則被廣泛應用于轉基因食品的安全性評估。本文基于PTN樣本系統(tǒng)通過分析GM水稻T13、T22與其對照樣本之間的稻米油脂含量及脂肪酸組分差異，追溯非預期效應的技術來源，發(fā)現轉基因技術影響稻米總油脂含量。如T13油脂含量比P1降低了21.79%，T22的油脂含量比P2增加了20.87%，但兩個 GM株系的油脂含量(2.62%和2.49%)仍介于P1(3.35%)和P2(2.06%)之間(表1)。這與前人報道的結果類似，即轉基因稻米的油脂含量變異幅度低于天然水稻品種之間的差異［2，13］，說明轉基因技術對稻米總油脂含量的非預期變異效應小于天然的水稻品種基因型影響，屬于安全范圍內的非預期變異。分析GM稻米總油脂含量非預期效應的技術來源(表1)發(fā)現，T13和T22的油脂含量變異主要來源分別為轉基因插入突變效應和組織培養(yǎng)無性系變異效應，可見不同GM株系非預期變異效應的技術來源存在差異，原因在于它們分別屬于不同轉基因事件，這符合基因槍轉化法介導外源基因在受體基因組中隨機整合的技術特點。

本研究所有糙米樣本均檢測出12種脂肪酸，主要脂肪酸為棕櫚酸、油酸和亞油酸，且不飽和脂肪酸相對含量在74.16% ～75.60%之間(表2和表4)，與常規(guī)水稻品種的脂肪酸組成分析結果一致［15］。GM株系T13和T22與各自親本相比，糙米脂肪酸組分種類并未發(fā)生增減，只是某些脂肪酸的相對含量發(fā)生了非預期變異，這與前人對GM稻米脂肪酸非預期變異效應的研究結果類似［2，5－6，12，16］。根據 TOST程序判斷，T13只有亞麻酸的相對含量與P1實質不等同，而T22品系有8種脂肪酸組分的相對含量與P2不等同(表3和表5)，說明稻米脂肪酸組分變異在不同GM品系間差異較大，GM作物的安全性評估應遵循個案分析原則。

基于實質等同性原則和TOST評判標準，結合PTN系統(tǒng)參照樣本的變異效應技術來源追溯結果，可知GM水稻T22稻米中的花生酸、鱈油酸和芥酸相對含量屬于實質不等同的非預期變異，變異效應來源包括轉基因穿梭效應和轉基因插入突變效應，需要進一步安全性評估。從食品安全角度，雖然T22稻米花生酸和鱈油酸相對含量與P2相比增加幅度分別高達303.34%和124.41%，但實際相對含量只有1.21%和0.86%，而且這兩種脂肪酸都是食品中常見的不限量營養(yǎng)脂肪酸，因此這種變異是安全的。至于芥酸，由于攝入芥酸含量為10% 以上的菜籽油能夠抑制大鼠的生長性能和肝組織長鏈脂肪酸的氧化速率，增加芥酸在不同組織中的累積，并導致心肌脂肪代謝障礙，因此美國FDA規(guī)定芥酸含量不超過2%才被允許添加到成人和兒童食品中，而不允許添加到嬰兒食品中。GB 1536—2004《菜籽油》規(guī)定脂肪酸組成中芥酸含量小于3%為低芥酸菜籽油［17］。根據糙米油脂含量和芥酸相對含量估算，本文8個供試樣本的糙米芥酸含量位于0.04%～0.09%之間，遠低于限量標準，不存在安全風險。T22稻米芥酸相對含量比P2降低了23.69%，該變異對其食用安全性更有利。綜合而言，供試的2個GM株系稻米油脂含量和組分確實存在非預期變異效應，會影響其營養(yǎng)品質，但并不存在食品安全隱患。只是GM水稻不同株系間差異較大，安全性評估要嚴格遵循個例分析原則。