鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌Nrf2—Notch1信號軸的影響機制研究

王敏 劉其禮 許帥 李品玉 李俊濤

[摘要] 目的 探討鴉膽子苦醇在非小細胞肺癌A549、H460細胞增殖中的作用。 方法 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測鴉膽子苦醇對A549、H460細胞的半數抑制濃度（IC50）；Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態學變化；通過CCK-8法檢測細胞活力；Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡；Western blot免疫印跡法檢測A549、H460細胞Nrf2、Notch1蛋白表達。 結果 鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞的IC50分別為（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L；流式細胞試驗結果顯示，鴉膽子苦醇處理后A549、H460細胞凋亡率顯著升高，與對照組比較差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）；Western blot檢測結果顯示，鴉膽子苦醇可降低細胞內Nrf2、Notch1的蛋白表達。 結論 鴉膽子苦醇可以抑制A549、H460細胞的生長，其機制可能與抑制Nrf2-Notch1信號軸有關。

[關鍵詞] 鴉膽子苦醇；非小細胞肺癌；Nrf2；Notch1；細胞生長

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0016-04

Study on the mechanism of the influence of Brusatol for the Nrf2-Notch1 axis of non-small cell lung cancer

WANG Min LIU Qili XU Shuai LI Pinyu LI Juntao

Faculty of Basic Medicine， Zhaoqing Medical College， Guangdong Province， Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Brusatol in the proliferation of A549 and H460 cells of non-small cell lung cancer. Methods The median inhibitory concentration （IC50） of Brusatol for A549 and H460 cells was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. Through hoechst33258 staining， the morphological changes of cell apoptosis were observed under the inverted fluorescence microscope. The cell viability was detected by CCK-8. The cell apoptosis was tested by Annexin-V-FITC/PI staining. The expression of Nrf2 and Notch1 protein of A549 and H460 cells was measured by Western blot. Results The IC50 of A549 and H460 cells dealt with Brusatol was （0.70±0.03）， （0.47±0.05） μmol/L respectively. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rates of A549 and H460 cells dealt with Brusatol were increased obviously， which had highly statistically significant differences compared with those of control group （all P < 0.01）. The results of Western blot showed that Brusatol could decrease the expression of Nrf2 and Notch1 protein. Conclusion Brusatol can inhibit the growth of A594 and H460 cells， the mechanism may be related to the inhibition of Nrf2-Notch1 axis.

[Key words] Brusatol； Non-small cell lung cancer； Nrf2； Notch1； Cell growth

鴉膽子苦醇（Brusatol）是一種苦木內酯類化合物，從鴉膽子中提取獲得。鴉膽子苦醇具有抗炎、驅蟲、抗瘧、抗癌等多種生物學功能。既往研究發現，鴉膽子苦醇可調節Nrf2信號通路的表達[1]。Nrf2信號通路是內源性的抗氧化通路。當細胞處于穩態時，細胞內Nrf2處于低水平狀態[2]。當細胞受到外界刺激時，Nrf2進入細胞核，與相應的抗氧化作用元件結合，啟動下游一系列抗氧化物酶，如血紅素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases）等的表達，從而起到對機體的防護作用[3]。Kitamura等[4]認為Nrf2及其下游蛋白的高表達與腫瘤細胞的增殖、存活有關。Notch1信號通路主要參與細胞的分化、凋亡等過程[5]。Natsuizaka等[6]證實抑制Notch1活性可顯著降低腫瘤細胞的增殖和生長速度。有文獻報道，Nrf2信號通路可與Notch1信號通路有交叉互作反應，如：Nrf2缺陷表達小鼠中，Notch1表達有所下降[7-8]。目前，鮮見鴉膽子苦醇對Nrf2及Notch1信號通路共同影響的研究，同時，鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌生長、存活的影響機制還不完善。因此，本研究以Nrf2-Notch1信號軸為研究基礎，探討鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌生長的影響及作用機制，為非小細胞肺癌靶向藥物的研制提供一定的實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

鴉膽子苦醇購自上海同田生物技術股份有限公司（批號：112586）；二甲基亞砜（DMSO）（批號：STBG-9203）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號：STBG9651）購自Sigma公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自東仁化學科技有限公司（批號：KJ651）；Hoechst33258購自Thermo Fisher公司（批號：1842729）；胎牛血清購自美國Hyclone公司（批號：AB10114599）；RPMI-1640培養基購自美國Gibico公司（批號：1868807）；Nrf2（批號：BL671）、Notch1（批號：BL549）購自Cell Signaling Technology公司；β-actin（批號：CJ39154）、HRP標記的山羊抗兔（批號：CJ36131）購自巴傲得生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

非小細胞肺癌細胞系A549、H460購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，放置于5%CO2、37℃恒溫培養箱（Thermo，美國）中培養。

1.3 半數抑制濃度（IC50）計算

將對數期細胞A549、H460細胞5000個接種于96孔板24 h后，加入不同濃度（0.175、0.35、0.70、1.4、2.8 μmol/L）的鴉膽子苦醇，并以相同濃度的DMSO作為對照，培養48 h后，每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h后，棄上清，加入200 μL DMSO，10 min振蕩后，于酶標儀檢測570 nm處細胞的OD值，并計算細胞IC50。

1.4 細胞形態學觀察

將對數期細胞接種于6孔板中，培養24 h，加入0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞后繼續孵育24 h，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，加入200 μL Hoechst33258染液，作用5 min，PBS清洗2次，熒光顯微鏡下形態學觀察。

1.5 細胞存活的測定

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞24 h后，每孔2000個細胞數接種于96孔板，培養24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養2 h后酶標儀檢測450 nm處細胞OD值，即可間接反映細胞的增殖。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.6 細胞凋亡的檢測

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞24 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗3次，1000 r/min離心5 min（r = 9.5 cm），加500 μL Binding緩沖液重懸細胞，避光，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，流式細胞儀上機檢測。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.7 Western blot檢測蛋白水平

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞24 h后，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，加1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，細胞刮刀收集細胞，超聲破碎細胞，4°C，10 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清。BCA法檢測蛋白濃度，50 μg蛋白進行上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白電泳分離，PVDF轉膜后，5%BSA封閉。一抗孵育4°C過夜，次日，二抗室溫2 h，Alpha Innotech FluorChem？郇Q多色熒光凝膠成像分析系統進行曝光，AlphaView SA3.4.0軟件進行數據處理和分析。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞增殖的抑制作用

鴉膽子苦醇對A549、H460細胞都有一定的抑制作用。鴉膽子苦醇對A549、H460細胞的IC50分別為（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L。本研究選擇0.70、0.47 μmol/L的鴉膽子苦醇作為處理A549、H460細胞的后續實驗藥物劑量。

2.2 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞存活的影響

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞，孵育12、24、48 h后，A549、H460細胞存活降低。H460細胞的抑制效果與A549抑制效果無差異。見圖1。

2.3 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞形態學影響

鴉膽子苦醇0.70、0.47 μmol/L分別處理A549、H460細胞24 h后，與對照組均勻熒光比較，A549、H460細胞的細胞核呈現致密濃染顆粒狀狀態，可見明顯凋亡小體的出現（圖2箭頭所示）。對凋亡小體進行統計學分析，發現處理組A549、H460細胞與對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

與對照組比較，**P < 0.01

2.4 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞凋亡的影響

如圖3所示，A549細胞株中，對照組凋亡率為4.66%，鴉膽子苦醇處理24 h后，細胞凋亡率上升至36.7%；H460細胞株中，對照組凋亡率為5.76%，鴉膽子苦醇處理24 h后，細胞凋亡率上升至53.8%。

2.5 鴉膽子苦醇對Nrf2信號通路的影響

如圖4所示，0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞24 h后，兩種細胞中Nrf2蛋白被抑制，同時，Notch1蛋白也被抑制。

3 討論

鴉膽子苦醇作為傳統中藥，含有多種苦木內酯類化合物，研究表明這類化合物具有抗癌、抗炎、抗瘧疾等多種功效，但目前關于鴉膽子苦醇的生物學效應及作用機制研究較少[9]。本研究主要探究鴉膽子苦醇作用于人肺癌細胞的相關生物學效應。

Nrf2調控的靶基因主要有各種抗氧化或解毒蛋白，這些靶基因的激活是機體抵御氧化應激損傷的主要作用因子。Nrf2信號通路的激活可以抵抗外界對細胞的不利刺激[10]，有研究表明[11]，304例非小細胞肺癌患者組織樣本中，Nrf2蛋白的高表達發生率為26%。此外Nrf2的高表達在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌細胞中也被發現[12-14]，Nrf2的高表達可以增強腫瘤細胞的增殖、輻射抗性和藥物抗性[15]。A549、H460細胞都被證實有Nrf2蛋白的高表達[16]，說明A549細胞和H460細胞具有較強的抗外界刺激的能力。

本研究發現，鴉膽子苦醇誘導A549細胞的濃度大于鴉膽子苦醇處理H460細胞的濃度，說明A549細胞相比H460細胞具有更強的抗性。鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞后，細胞呈現致密濃染的顆粒狀熒光，其細胞核出現凋亡小體，聯合流式細胞術檢測結果，鴉膽子苦醇處理細胞可以誘導非小細胞肺癌發生凋亡。有研究表明，鴉膽子苦醇是Nrf2的抑制劑[17]。在本研究中，經鴉膽子苦醇處理后，非小細胞肺癌A549和H460細胞中Nrf2的蛋白表達明顯降低，推測Nrf2蛋白含量的降低有可能是鴉膽子苦醇誘導細胞凋亡的原因之一。有報道顯示，10%的非小細胞肺癌患者呈現Notch1的高表達狀態，同時這一高表達與患者低治愈率有關[18]。下調Nrf2可降低非小細胞肺癌中Notch1及其下游蛋白Hes1等蛋白的表達[19]。本研究檢測了Notch1蛋白的表達，發現經鴉膽子苦醇處理后的細胞中Notch1的蛋白表達也有所下降，該結果提示，鴉膽子苦醇有可能是通過抑制Nrf2-Notch1這一信號軸，來實現降低A549、H460細胞增殖與存活并增強腫瘤細胞凋亡的目的。本研究結果提示，鴉膽子苦醇可以作為治療非小細胞肺癌的潛在藥物，為臨床治療非小細胞肺癌提供一定的指導作用。

[參考文獻]

[1] Mei W，Shi G，Bian C，et al. UVA Irradiation Enhances Brusatol-Mediated Inhibition of Melanoma Growth by Downregulation of the Nrf2-Mediated Antioxidant Response [J]. Oxid Med Cell Longev，2018，2018：9742154.

[2] Basak P，Sadhykhan P，Sarkar P，et al. Perspectives of the Nrf-2 signaling pathway in cancer progression and therapy [J]. Toxicol Rep，2017，4：306-318.

[3] Uchida H，Nakajima Y，Ohtake K，et al. Protective effects of oral glutathione on fasting-induced intestinal atrophy through oxidative stress [J]. World J Gastroenterol，2017， 23（36）：6650-6664.

[4] Kitamura H，Motohashi H. NRF2 addiction in cancer cells [J]. Clin Lung Cancer，2018，109（4）：900-911.

[5] Mack JJ，Mosqueiro TS，Archer BJ，et al. NOTCH1 is a me-chanosensor in adult arteries [J]. Nat Commun，2017，8：1620.

[6] Natsuizaka M，Whelan KA，Kagawa S，et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma [J]. Nat Commun，2017，8（1）：1758.

[7] Wakabayashi N，Shin S，Slocum SL，et al. Regulation of notch1 signaling by nrf2：implications for tissue regeneration [J]. Sci Signal，2010，3（130）：ra52.

[8] Wakabayashi N，Chartoumpekis DV，Kensler TW，et al. Cr-osstalk between Nrf2 and Notch signaling [J]. Free Radic Biol Med，2015，88（Pt B）：158-167.

[9] 傅麗霞，黃崇剛，林明寶，等.鴉膽子苦木內酯類成分及其藥理活性研究進展[J].中國藥理學通報，2016，32（11）：1481-1486.

[10] Liddell JR. Are Astrocytes the Predominant Cell Type for Activation of Nrf2 in Aging and Neurodegeneration？ [J]. Antioxidants（Basel），2017，6（3）：E65.

[11] Solis LM，Behrens C，Dong W，et al. Nrf2 and Keap1 abnormalities in non-small cell lung carcinoma and association with clinicopathologic features [J]. Clin Cancer Res，2010，16（14）：3743.

[12] Romero R，Sayin VI，Davidson SM，et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in a dependence on glutaminolysis [J]. Nat Med，2017，23（11）：1362-1368.

[13] Jung BJ，Yoo HS，Shin S，et al. Dysregulation of NRF2 in Cancer：from Molecular Mechanisms to Therapeutic Opportunities [J]. Biomol Ther（Seoul），2018，26（1）：57-68.

[14] Taguchi K，Yamamoto M. The KEAP1-NRF2 System in Cancer [J]. Front Oncol，2017，7：85.

[15] Malavolta M，Bracci M，Santarelli L，et al. Inducers of Senescence，Toxic Compounds，and Senolytics：The Multiple Faces of Nrf2-Activating Phytochemicals in Cancer Adjuvant Therapy [J]. Mediators Inflamm，2018，2018：4159013.

[16] Singh A，Bodas M，Wakabayashi N，et al. Gain of Nrf2 Function in Non-Small-Cell Lung Cancer Cells Confers Radioresistance [J]. Antioxid Redox Signal，2010，13（11）：1627-1637.

[17] Ma R，Li H，Zhang Y，et al. The toxic effects and possible mechanisms of Brusatol on mouse oocytes [J]. PLoS One，2017，12（5）：e0177844.

[18] Westhoff B，Colaluca IN，D'ario G，et al. Alterations of the Notch pathway in lung cancer [J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（52）：22293-22298.

[19] Zhao Q，Mao A，Yan J，et al. Downregulation of Nrf2 promotes radiation-induced apoptosis through Nrf2 mediated Notch signaling in non-small cell lung cancer cells [J]. International J Oncol，2016，48（2）：765-773.

（收稿日期：2018-02-26 本文編輯：張瑜杰）