cTfh細胞及相關miR—146a在乙肝疫苗記憶性免疫應答中的動態表達及關聯研究

余祖衛　李玉蓮　陳麗華　尹明娟　黃玲鳳　張艷

[摘要]目的 檢測乙肝疫苗記憶性免疫應答過程中miR-146a與外周血濾泡輔助性T細胞（cTfh）動態表達水平，分析miR-146a、Tfh與乙肝疫苗免疫應答之間的相關性。方法 于2017年7月招募大朗社區衛生服務中心已完成3針乙肝疫苗標準程序的健康成人接種1針乙肝疫苗，收集12例健康志愿者的外周血標本。在疫苗接種后的不同時間點，采用ELISA法測定血清中乙肝表面抗體（HBsAb）濃度；采用流式細胞術檢測外周血單個核細胞（PBMC）中Tfh細胞、B細胞、漿細胞、記憶性B細胞的比例；采用熒光定量PCR檢測miR-146a的相對表達量。結果 cTfh在疫苗接種后第7天達到最高（P=0.001），HBsAb水平在疫苗接種后第14天達到最高，差異有統計學意義（P<0.001）。Tfh細胞與B細胞成負相關（r=-0.426，P=0.03），漿細胞與HBsAb成正相關（r=0.330，P=0.04）。miR-146a與cTfh、HBsAb均無相關性（P>0.05）。結論 Tfh細胞可能參與乙肝疫苗記憶性免疫應答過程，但未能證明miR-146a與乙肝疫苗免疫應答存在相關性。

[關鍵詞]miR-146a；濾泡輔助性T細胞；乙肝疫苗；免疫應答；相關性

[中圖分類號] R512.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）7（b）-0012-04

[Abstract] Objective To detect the dynamic expression levels of miR-146a and circulating T follicular helper （cTfh） cell during immune response of hepatitis B vaccination， and then analyze the association between miR-146a， cTfh cell and the immune response of hepatitis B vaccination. Methods In July 2017， a group of healthy adults who had completed the standard procedure for the hepatitis B vaccination in Community Health Service Center of Dalang Country were recruited to receive one dose of hepatitis B vaccination， and peripheral blood samples were collected from 12 volunteers at different time points after vaccination， ELISA method was used to measure the concentration of Hepatitis B surface antibody （HBsAb） in serum； Flow cytometry was used to detect the proportion of Tfh cells， B cells， plasma cells， and memory B cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of miR-146a. Results cTfh cell reached the highest level （P=0.001） on the 7th day after vaccination， and the HBsAb reached the highest level on the 14th day after vaccination， and the difference was statistically significant （P<0.001）. There was a negative correlation between the Tfh cells and B cells （r=-0.426， P=0.03）， and a positive correlation between the plasma cells and HBsAb （r=0.330， P=0.04）. There was no significant correlation between the expression level of miR-146a， cTfh cell and HBsAb （P>0.05）. Conclusion Tfh cells might play a role in the immune response to hepatitis B vaccination， but not demonstrate the association between miR-146a and the immune response of hepatitis B vaccination.

[Key words] miR-146a； T follicular helper cell； Hepatitis B vaccination； Immune response； Association

乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是全球性公共衛生問題，每年約有100萬人死于乙肝感染，迄今并無特效治療方法。世界衛生組織（WHO）指出接種乙肝疫苗是控制HBV感染最經濟、有效的措施。研究表明按標準程序接種后仍有5%～10%的健康人群不能產生保護性的抗體水平，處于無/弱應答狀態（<10 IU/ml為無應答者，10～100 IU/ml為弱應答者），該人群仍對HBV易感[1]。

乙肝疫苗弱應答的發生機制尚不清楚，乙肝疫苗免疫應答的機制研究可以為乙肝疫苗弱應答機制研究提供思路。濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cells，Tfh細胞）是近年來發現主要輔助B細胞的T細胞亞群，對B細胞增殖與分化、高親和力抗體的產生、抗體的類別轉換、免疫記憶的發生是不可或缺的[2]。相關文獻報道外周血中ICOS+CXCR3+CXCR5+CD4+T細胞與流感疫苗免疫應答相關[3]，Crotty[4]報道了增加Tfh細胞可以增強狂犬疫苗的保護效果，而Tfh細胞是否參與乙肝疫苗免疫應答尚不清楚。

miRNA介導的轉錄后調節在Tfh細胞分化、發育過程中都發揮著關鍵性作用[5]。在這些與免疫調節相關的miRNAs中，多個研究證明miR-146a是調控Tfh細胞分化和功能的關鍵性miRNA[6-7]。在Tfh細胞中miR-146a表達水平明顯高于其他效應T細胞，miR-146a可以直接靶向作用Tfh細胞上的ICOS，對Tfh細胞分化起制約作用，防止過度免疫反應發生[8]。

本研究旨在探討Tfh細胞及其miR-146a與乙肝疫苗免疫應答是否存在關聯，為進一步闡明乙肝疫苗弱應答發生機制提供理論參考。

1資料與方法

1.1一般資料

于2017年7月招募東莞市大朗社區衛生服務中心健康志愿者12例，男、女各6例，年齡23～36歲，體重42～68 kg。納入標準：①愿意全程參與實驗，并服從實驗安排；②無基礎疾病，未感染過HBV；③最近1年內未接種過乙肝疫苗。排除標準：①對疫苗存在過敏反應；②實驗期間發生其他感染性疾病。告知研究對象研究內容與目標，簽署知情同意書。本研究經廣東醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器

重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）供應商為葛蘭素史克生物制劑公司；ELISA試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司；鼠抗人CD19-PE、鼠抗人CD-27-FITC、鼠抗人CD38-BV421均購自BD公司；鼠抗人CD4-PerCP、鼠抗人CXCR5-PE均購自eBioscience公司；淋巴細胞分離液、EasySepTM human CD4+ T-cell enrichment kit均購自STEMCELL公司；TRIzol試劑購自Invitrogene公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit、FastStartUniversal SYBR Green Master試劑均購自Roche公司。儀器主要有多功能酶標儀（購自BioTekInstruments 公司）、流式細胞儀（BD公司）、基因擴增儀（Eppendorf公司）、PikoREAL熒光定量PCR（Thermo公司）。

1.3方法

1.3.1乙肝疫苗接種 所有實驗對象在大朗社區衛生服務中心預防接種門診接種乙肝疫苗，接種部位與方式為上臂外側三頭肌，肌內注射。接種乙肝疫苗后，預約安排采血時間，于接種疫苗前和接種后第7、14、28天采集受試者晨起空腹靜脈血。采血部位為肘前靜脈，采血量為20 ml左右。

1.3.2 ELISA法檢測血清中HBsAb濃度 將采血管室溫靜置30 min，待有血清析出，每管收集200 μl血清-80℃保存、備用。ELISA法檢測血清中HBsAb濃度（具體操作步驟參照說明書），多功能酶標儀測量吸光度。

1.3.3流式細胞術檢測外周血Tfh細胞、B細胞、漿細胞、記憶性B細胞的比例變化 利用淋巴細胞分離液通過梯度離心法分離外周靜脈血單核細胞（PBMC）。取兩管1×106外周血單核細胞，用1 ml Buffer液重懸細胞300 g，室溫離心10 min，棄上清，再用100 μl重懸細胞，一管加流式抗體CD4-PerCP、CXCR5-PE，另一管加入流式抗體CD19-PE、CD27-FITC、CD38-BV421，用移液器輕輕吹打混勻，避光室溫孵育30 min，孵育結束后加入1 ml Buffer，重懸細胞300 g，室溫離心10 min，棄上清，用400 μl 2%多聚甲醛固定細胞，所得樣品使用流式細胞儀檢測，結果以“%”表示。

1.3.4 qRT-PCR檢測miR-146a相對表達量 在PBMC細胞基礎上用免疫磁珠法富集人外周血中CD4+細胞。用500 ulTRIzol裂解CD4+細胞，提取總RNA，使用miR-146a莖環法反轉錄引物、逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以U6為內參進行定量PCR，反應程序為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 34 s，40個循環。引物序列詳見表1，以U6為內參測定miR-146a的mRNA表達情況。

1.4統計學方法

使用SPSS 15.0和GraphPad Prism 5統計學軟件進行數據分析和相關性分析，不同時點均數比較采用重復測量資料的方差分析，相關性采用雙變量相關性分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 HBsAb濃度動態變化

用ELISA方法檢測血清中的HBsAb濃度，結果顯示接種疫苗后HBsAb濃度顯著增高，于第14天達到最高，差異有統計學意義（F=50.3，P<0.001）（表2）。

2.2外周血中Tfh細胞、B細胞亞群的動態變化

通過熒光抗體進行標記，用流式細胞術檢測外周血中Tfh細胞（CXCR5+CD4+T細胞）、B細胞（CD19+）、漿細胞（CD19+CD27+CD38+）、記憶性B細胞（CD19+CD27+CD38-）比例。流式分析圈門策略見圖1。結果顯示接種乙肝疫苗后Tfh細胞增高，于第7天達到最高，差異有統計學意義（F=8.46，P=0.001）；接種乙肝疫苗后B細胞、記憶性B細胞均減少，差異無統計學意義（F=0.24，P=0.869；F=1.37，P=0.285）；接種乙肝疫苗后漿細胞增高，于第28天達到最高，差異有統計學意義（F=5.24，P=0.009）（表2）。

2.3 CD4+細胞中miR-146a表達水平

通過qRT-PCR檢測CD4+細胞中miR-146a mRNA表達水平，結果顯示接種乙肝疫苗后miR-146a處于動態變化，均于第14天表達量達到最高，差異有統計學意義（F=9.88，P=0.003）（表2）。

2.4相關性分析

分別對miR-146a與Tfh細胞進行相關性分析，結果顯示，miR-146a與Tfh細胞無相關性（r=-0.068，P=0.71）（圖2-A）；將miR-146a與HBsAb進行相關性分析，結果顯示，miR-146a與HBsAb無相關性（r=-0.085，P=0.64）（圖2-B）；將Tfh細胞與B細胞、漿細胞與HBsAb進行相關性分析，結果顯示，Tfh細胞與B細胞成負相關（r=-0.426，P=0.03），漿細胞與HBsAb成正相關（r=0.330，P=0.04）（圖2-C、圖2-D）。

3討論

目前，乙肝疫苗弱應答的發生機制尚未明確，但由于乙肝疫苗激發機體免疫反應是T細胞依賴的，所以國內外絕大多數學者認為，T細胞的輔助作用是乙肝疫苗弱應答發生的關鍵。自乙肝疫苗推廣使用以來，輔助性T細胞（T helper cell，Th）一直是乙肝疫苗弱應答發生機制研究的熱點[9-10]，近年來發現Tfh細胞才是主要輔助B細胞的T細胞亞群，而miRNA廣泛參與T細胞激活及免疫應答調節。目前，Tfh細胞及相關miR-146a是否與乙肝疫苗免疫應答存在關聯未見報道。因此，明確Tfh細胞及相關miRNA在乙肝疫苗免疫應答中的作用，對進一步闡明其在乙肝疫苗弱應答發生機制有重要參考價值，并為新型乙肝疫苗佐劑研制、HBV感染的防控提供科學依據。

由于人體接種乙肝疫苗后外周血中CXCR5+CD4+T細胞（cTfh）也具有Tfh細胞相同的表型特征，在轉錄調控機制上與Tfh細胞有共同之處，且同樣具有輔助B細胞功能[11]。在人的淋巴組織樣本難以獲得情況下，采用cTfh細胞作為替代物是目前普遍且可行的研究方法。研究結果顯示，接種乙肝疫苗之后cTfh細胞構成比于第7天達到最高，提示其參與乙肝疫苗免疫應答的過程。體液免疫過程中，漿細胞可以合成、分泌抗體，結果顯示接種疫苗之后漿細胞的比例增高，HBsAb表達水平增高，提示接種乙肝疫苗之后Tfh細胞數量增多，增強乙肝疫苗免疫應答。此外，相關性分析顯示cTfh細胞與B細胞成負相關趨勢，而漿細胞與抗體成正相關趨勢，提示在乙肝疫苗免疫應答過程中cTfh細胞增高可以輔助B細胞分化為漿細胞產生抗體，促進免疫應答。而相關性分析顯示，miR-146與cTfh細胞、HBsAb均無相關性，提示miR-146可能并不參與乙肝疫苗的免疫應答過程。

綜上所述，Tfh細胞可能在乙肝疫苗免疫調節中起重要作用，而miR-146并不能通過調控Tfh細胞參與乙肝疫苗免疫應答的過程。Tfh細胞是否參與乙肝疫苗弱應答發生過程以及作用機制還需進一步研究。

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（收稿日期：2018-04-12 本文編輯：閆 佩）