天花粉蛋白對肝癌細胞的放射增敏作用及機制研究

陳幼芬，夏釹，田炳如

作者單位： 315400浙江省余姚，余姚市人民醫院

天花粉蛋白是從我國傳統中藥葫蘆科植物栝蔞中提取的I型單鏈核糖體失活蛋白，最初主要用于婦科疾病的治療。隨后研究發現，天花粉蛋白對眾多腫瘤具有抗瘤作用，提示天花粉蛋白可能成為腫瘤治療的一個新靶點。本研究采用天花粉蛋白處理人肝癌細胞株 HepG2細胞，旨在探討其對肝癌放射敏感性的影響及其可能作用機制。

陳幼芬，夏釹，田炳如.天花粉蛋白對肝癌細胞的放射增敏作用及機制研究

圖1 天花粉蛋白對放射誘導HepG2細胞凋亡的影響（Annexin V-FITC-PI雙染法

圖2 透射電鏡觀察HepG2細胞凋亡（A為正常細胞 B為凋亡細胞）

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞株 HepG2由浙江大學醫學院附屬第一醫院提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 天花粉蛋白購自上海金山制藥有限公司。Annexin VFITCKit購自 Immunotech Company（France）。Epics-XLⅡ型流式細胞儀（Beckman-Coulter Company，USA），JEM-1230型透射電鏡（LEOLCompany，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2培養于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養液中，置37℃、5%CO2恒溫培養箱內。取指數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測藥物毒性及適宜濃度 以每孔6×103個細胞接種于96孔板，貼壁后加入天花粉蛋白，其濃度設0、25、50、100、200 mol/L 5個濃度組，每個濃度組各取12、24、48、72h 4個時間點檢測，設不接種細胞的空白對照和只含 1‰DMSO的對照組，每濃度每時間點重復4孔。采用 MTT法在酶聯免疫檢測儀上測定490 nm處吸光度值（A），細胞存活率（%）=實驗孔A值/對照孔A值×100%。

1.2.3 克隆形成實驗分析放射增敏效應

制備單細胞懸液，根據不同照射劑量接種適量細胞于75 mm2培養皿中，實驗分兩組：（1）單照組：細胞接種24h貼壁，繼續培養24 h，室溫下分別接受0、2、4、6、8、10 Gy 的 6MV X-ray 照射；（2）聯合組：照射＋天花粉蛋白處理。細胞接種24h貼壁，聯合組更換含50 mol/L的天花粉蛋白培養液，兩組繼續培養24h，室溫下分別接受 0、2、4、6、8、10 Gy的6MV X-ray照射，照射后聯合組更換無藥培養液與單照組一起繼續培養14d。甲醇固定，姬姆薩染色，計數＞50個細胞克隆數。經單純用藥校正后計算存活分數（SF），實驗結果為3次平均值。以多靶單擊數學模型擬合細胞存活曲線，計算參數平均致死劑量（D0）、準閥劑量（Dq）及放射增敏比（SER）值。

1.2.4 流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡率 實驗分4組：（1）未處理組；（2）單藥組：含50 mol/L的天花粉蛋白培養液培養 24 h；（3）單照組：6 Gy 照射劑量；（4）聯合組（照射+藥物）。各組取處理后細胞 1×106個，按Annexin V-FITCKit說明書操作，加PI和Annexin V-FITC雙染液上機檢測，利用Coulter公司的SystemⅡTM軟件處理結果，每次實驗均設陰性和陽性對照，并設3復孔。

1.2.5 透射電鏡觀察凋亡 收集聯合組HepG2細胞，2.5%戊二醛固定，2%瓊脂包埋，再用1%鋨酸固定，逐級乙醇脫水，氧化丙烯浸透，樹脂包埋，超薄切片機切片，透射電子顯微鏡下觀察并攝影。

1.3 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件進行分析，計量資料用±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料采用2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 天花粉蛋白對HepG2細胞生長的影響 MTT法測定結果顯示，天花粉蛋白對 HepG2細胞有明顯的抑制生長作用，24 h其細胞存活率最高為（95.97±2.13）%（25 mol/L），最低為（64.20±2.29）%（200 mol/L)，IC50 為266.5 mol/L。為盡量避免藥物本身對細胞的毒性作用，在隨后的實驗中天花粉蛋白都采用50 mol/L濃度。

2.2 天花粉蛋白的放射增敏作用 天花粉蛋白可顯著增加 HepG2細胞的放射敏感性（圖1）。單照組和聯合組的D0值分別1.74、1.35Gy；Dq值分別為2.46、1.56 Gy；SER 為 1.30。

2.3 天花粉蛋白誘導凋亡 FCM 顯示單藥組的凋亡率為（6.03±0.98）%，單照組為（7.64±1.13）%，未處理組為（1.73±0.49）%，聯合組為（17.90±2.01）%；4組凋亡率差異有統計學意義（F=9.28，P＜0.05）。單藥組和單照組的凋亡率高于未處理組（均P＜0.05），聯合組凋亡率明顯高于單照組和單藥組（均P＜0.05）。見封四彩圖1。

2.4 透射電鏡觀察 經藥物聯合照射處理后的細胞體積縮小，胞膜完整，但發生皺縮，染色質凝聚、固縮、邊聚，部分出現核碎裂，胞質出芽，凋亡小體形成。見封四彩圖2。

3 討論

天花粉蛋白是從中藥天花粉中提取純化的一種活性蛋白，已有研究提示具有抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡[1-3]；增強NK細胞的殺傷活性[4]以及免疫調節[5]等作用，有著良好的研究前景及應用價值。本研究發現25～200 mol/L濃度的天花粉蛋白對HepG2細胞均有增殖抑制作用；天花粉蛋白聯合放射組的細胞生存率較單照組明顯降低，即天花粉蛋白對HepG2細胞具有明顯的放射增敏作用。

細胞凋亡是一種受基因調控的不同于細胞壞死的特殊類型的細胞死亡，在抗癌藥物的藥理機制研究中占有重要地位，近年來倍受醫學界的關注。齊躍東[1]的研究提示天花粉蛋白通過干擾人大腸癌細胞株 LoVo、人結腸癌細胞株SW-1116及人胃癌細胞株MKN-45的細胞增殖，誘發細胞凋亡來實現抗腫瘤作用。You等[6]的研究也提示天花粉蛋白增加TRAIL抵抗非小細胞肺癌的細胞凋亡及細胞周期阻滯。Zhang等[7]在對幾種傳統中藥對腫瘤研究中發現天花粉蛋白通多 Bcl-PARP通路誘導對肝癌細胞的凋亡誘導作用最為明顯。本研究發現天花粉蛋白通過誘導HepG2細胞的凋亡，實現抗腫瘤作用，與上述研究結果一致。

綜上所述，在腫瘤的放射治療中，放射導致細胞凋亡是放射誘導腫瘤細胞死亡的一種形式。放射誘導DNA損傷，激活的P53進行損傷修復，不可修復的損傷將激活凋亡信號通路誘導細胞凋亡。本研究發現放射可誘導HepG2細胞的凋亡，且天花粉蛋白可進一步上調放射對 HepG2細胞的凋亡誘導作用；其增敏機制可能與上調細胞凋亡有關，相關機制有待進一步探討。ACS Appl Mater Interfaces,2017,9(32)：26648-26664.

圖1 HepG2細胞單照射和聯合天花粉蛋白作用后的生存曲線