上皮細胞黏附分子和滋養層細胞表面抗原 2在大鼠梗阻性肝損傷動物模型中的研究

溫力牧，夏醫君

作者單位： 315040寧波，寧波市醫療中心李惠利東部醫院（溫力牧）；內蒙古自治區人民醫院（夏醫君）

梗阻性肝損傷（OHI）是指膽道系統因各種原因發生完全或不完全梗阻后，導致肝板破壞，肝血竇閉塞或竇周纖維化，假小體形成等一系列肝臟形態學和生物學改變[1]。以往研究表明短期的膽道梗阻引發的肝臟結構改變是可恢復的，如果梗阻超過一定時間，會造成肝臟結構的不可逆損傷，最終可發展為繼發性肝硬化[2]。隨著外科水平以及相關診斷技術水平的進步，對于早期的梗阻的發現和治療已經日趨標準化。但目前對于OHI的進程發展，臨床缺少梗阻及再通后肝功能治療恢復指南。

EpCAM通常認為是細胞表面黏附分子，其不僅作用于細胞之間的相互黏附[3]，并且通過釋放胞外域，同時實現胞內域的核轉位，同結構域蛋白、聯蛋白和淋巴增強子結合因子1形成復合核和觸發相關傳導信號，從而調節膜內蛋白水解[4]，是肝損傷后肝內側枝循環生成、肝纖維化中匯管區無功能的膽管細胞增生和以及相關膽管細胞腫瘤的發生中的關鍵環節。TACSTD基因家族的另一成員TROP2，與相關的轉錄因子形成調控網絡，以調節細胞的生長信號[5]。本文研究上皮細胞黏附分子（EpCAM）及滋養層細胞表面抗原2（TROP2）與大鼠梗阻性肝組織損傷進程的關系。現報道如下。

溫力牧，夏醫君.上皮細胞黏附分子和滋養層細胞表面抗原2 在大鼠梗阻性肝損傷動物模型中的研究

圖1 B組各時點HE染色結果（HE，×200）

圖2 C組各時點HE染色結果（HE，×200）

圖3 EPCAM免疫組化結果（蘇木素，×400）

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成熟雄性Wistar大鼠48只，年齡11周，體質量250～300g，由內蒙古大學實驗動物中心提供。無特定病原體級（SPF級），飼養于恒溫、清潔的環境中，以標準飼料喂養，并維持12h晝夜節律。

1.2 試劑 兔抗鼠EpCAM一抗、兔抗鼠TROP2一抗以及免疫組化試劑盒均購自北京奧博森生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒（20X）購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 實驗分組 成熟雄性Wistar48只大鼠，采用數字表方法隨機分成3組。對照組（A組）：行手術對照組，行開關術。結扎組（B組）：行硅膠管置入膽管結扎術。再通組（C組）：行硅膠管置入膽管結扎術后7天行再通。A、B組分別于術后第1、3、5、7d處死（每次處死4只，分組為A1～7，B1～7），C組于再通后第1、3、5、7d處死（每次處死4只，分組為C1～7）[6-7]。

1.4 動物模型制作 A組：術前12h禁食，6h禁水，稱量體質量，10%的水合氯醛3ml/kg腹腔麻醉。取正中切口，游離并顯露肝十二指腸韌帶后關腹，行假手術對照。B組：術前準備麻醉及切口同A組，剝離肝十二指腸韌帶，確認大鼠膽總管。于膽總管上行近肝門處取大小約0.5mm切口，置入硅膠管結扎固定，同理于膽總管下行胰腺上段置入硅膠管另一端，經皮下于頸背部引出。觀察背部引流的硅膠管是否有少量淡紅色或淺黃色液體流通，絲線結扎外管后關腹，做成膽管梗阻模型。C組：以B組相同方法建立膽管梗阻模型，梗阻7 d后剪斷背部結扎線，觀察是否有黃褐色液體流通，建立膽管再通模型。

1.5 觀察指標 （1）檢測血清酶學變化，主要包括總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT），腹主動脈取血樣送檢，由Cobas-8000c701全自動生化分析儀檢測完成；（2）肝臟石蠟制片HE染色光鏡下觀察肝組織樣本；（3）免疫組化采用SP法，按試劑盒說明進行EpCAM和TROP2的免疫組織化學染色。兩者均為細胞膜以及部分細胞質中出現黃褐色特異染色為陽性表達，每張切片均隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算細胞陽性表達率。表達率小于5%定義為陰性表達，表達率5～15%定義為弱陽性表達，表達率15～40%定義為中等陽性表達，表達率大于40%為強陽性表達[8]。

1.6 統計方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清酶學變化 急性膽道梗阻后，B組血清ALT、AST于術后第1～3 d迅速上升至高峰，而3～7d逐漸趨緩，并有逐漸下降趨勢；C組ALT、AST于解除梗阻后1～3 d持續保持高值，3 d后方出現降低。實驗檢測同時發現大鼠的血清TBIL以及DBIL于結扎后第5d方達到峰值，而5～7d趨于穩定，這同AST、ALT的變化進程并不完全一致，見表1。

2.2 HE染色結果 對照組各個樣本肝板結構清楚，中央靜脈無明顯擴張，匯管區內無增生小膽管及增生纖維細胞等異型結構出現。B組術后1 d匯管區稍顯增寬，肝小葉間纖維組織少量增生，炎細胞浸潤；術后3 d見局部小膽管增生，細胞間質嗜中性粒細胞等炎細胞浸潤較前明顯增多，小葉間纖維組織增生明顯，其中以匯管區膽管擴張、增生、異型為重；術后7d部分肝板形態改變，中央靜脈增寬，肝細胞可見灶狀、點片狀壞死，沿匯管區可見局部出現條索樣纖維增生，且有向周圍蔓延增生趨勢。隨結扎時間延長，大鼠肝臟損傷纖維化進程明顯加重。見封三彩圖1。

C組再通后1d大鼠肝細胞可見明顯壞死，肝小葉局部淡染灶，小葉間匯管區異型明顯，有細小膽管增生及纖維細胞條索樣結構出現；3 d肝板片狀壞死灶較前無顯著改變，原擴張異型明顯的中央靜脈形態逐漸恢復，匯管區結構較前清晰，其中增生膽管較多；5 d肝小葉形態結構逐漸恢復，其內可見點狀散在壞死灶；7d肝板內肝細胞壞死灶較前范圍縮小，且匯管區內纖維細胞形成的條索束裝結構可見減少。見封三彩圖2。

2.3 免疫組化結果

2.3.1 EpCAM免疫組化結果 A組為弱陽性表達；B組中隨結扎時間延長，其陽性細胞比率逐漸上升至結扎第5d峰值后持續保持平穩高值；C組中其陽性細胞比率逐步下降。3組陽性細胞比率在相同時間點差異均有統計學意義。見表2、見封三彩圖3。

2.3.2 TROP2免疫組化結果 A組中為陰性表達；B組中隨結扎時間延長，其陽性細胞比率逐漸升高；C組中陽性細胞比率隨再通時間延長始終保持高值。B組與C組陽性細胞比率在1、7 d差異均有統計學意義。見表3、封三彩圖4。

3 討論

3.1 大鼠梗阻性肝損傷的組織學改變 本實驗中大鼠肝臟梗阻后3d Metavir肝纖維化評分標準即達Ⅱ級，對比梗阻7 d肝組織可發現，肝組織增生異型多發生在匯管區，而肝板內肝細胞的壞死灶增多并不明顯。由此可推想急性梗阻性肝損傷在7 d內的主要部位集中在匯管區，是由局部纖維細胞形成積聚，無功能的小膽管增生，導致匯管區正常毛細膽管組織受壓迫，進一步誘導肝細胞變性壞死。

解除梗阻后，對比再通術后1 d和7 d切片，可見肝板片狀壞死灶減少并不明顯，原擴張明顯的中央靜脈形態逐漸恢復，匯管區結構較前清晰，提示7 d內再通術后肝組織匯管區結構恢復時序要早于肝細胞恢復，同時可推測知梗阻解除后肝小葉間的旁路代償作用逐漸減退，正常的膽管毛細引流通道可能是肝細胞恢復因素之一。

3.2 EpCAM 在梗阻性肝損傷中的表達與意義Laurent等[9]對肝前體細胞研究發現，應激狀態下EpCAM通過組織授予的相關信號片段，調節膜內蛋白水解生成，從而在肝前體細胞和增生膽管上皮細胞中出現強陽性表達。本實驗中，EpCAM不僅在細胞膜表面存在表達，而且局部胞質中也出現陽性染色，這可能與其在梗阻性肝損傷時，胞內結構域EpICD的核轉位作用密切相關[10]。結合Mladen等[11]研究可推測在急性膽道梗阻狀態下 EpCAM 陽性細胞比率增加可與肝損傷進程相關，由于再通后其陽性細胞數逐步下降，可認為其為急性梗阻期肝臟損傷程度進程指標；但對比同期組織切片，解除梗阻后術后3d肝細胞片狀壞死灶較前無顯著改變，匯管區增生膽管較多，而再通后5 d肝小葉形態結構逐漸恢復，膽管增生較前減少，可推測其對再通后后修復進程評估較差。

3.3 TROP2在梗阻性肝損傷中的表達與意義Okabe等[12]對出現梗阻性肝損傷的鼠肝臟中研究顯示，上皮細胞黏附分子相關蛋白TROP2在肝卵圓細胞中表達，其能誘導肝卵圓細胞代替造血干細（HSCs），分化成為肝細胞和膽管細胞。本實驗中TROP2陽性染色細胞大多分布在匯管區增生膽管細胞以及水腫的肝細胞胞質和細胞膜上，這與其他研究的表達部位并不完全一致，由于其信號傳導通路至今尚不清楚，且其與EpCAM高度相關，推測其在梗阻性肝損傷的急性期有除了傳導膜外信號可能有部分蛋白結構是經由胞質及胞核發揮作用。結合本實驗結果，預計梗阻性肝損傷后，TROP2在增生膽管細胞及部分肝前體細胞胞膜中持續呈陽性表達至肝組織形態恢復一定階段，由于隨解除再通時間延長，其陽性表達比率將穩定保持一定水平，借此可提示肝損傷后修復進程發展，但由于其梗阻與再通前后差異性不顯著，其難以判斷肝損傷中損傷進程發展。

表1 各組實驗血清學變化

表2 不同組別EPCAM陽性率表達%

表3 不同組別TROP2陽性率表達 %