血 HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 等位基因多態性與肝細胞癌發生關聯研究*

歐陽石，陳小平，程濤，鐘宋，劉崇文，肖露露，陳陽述

HBV感染呈世界性流行，但不同地區HBV感染的流行強度差異很大。據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌（HCC）[1]。在全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分別為30%和45%[2]。在我國肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分別為60%和80%[3]。2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查表明，1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%[4-6]。據此推算，我國有慢性HBV 感染者約9300萬人[7-9]。由于乙肝疫苗接種的普及，HBV感染明顯減少。臺北的一項研究對8733名在1987年7月后出生的高中生進行檢測，發現HBsAg陽性率為1.9%，同時抗HBs陽性率僅為48.3%，提示有相當部分完成免疫接種者仍會喪失對HBsAg的免疫記憶[10]。遺傳易感性是HCC發生的主要危險因素之一，在乙型肝炎發展為HCC的過程中起著關鍵性的作用[11]。人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）最顯著的特征是具有明顯的多態性，其多態性的差異決定免疫反應的不同。由于不同個體HLA等位基因的差異，表達不同的HLA抗原，對同一抗原的免疫應答強度也不同，進而導致疾病轉歸不同。因此，攜帶不同HLA基因個體對HBV感染的易感性、發展為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HCC發生均存在個體差異[11]。有關HLA基因多態性與HCC發生相關性的研究已經有一些報道，由于這些研究所選擇的人種和地域不同，得出的結論也存在差異。本研究采用聚合酶鏈反應-直接測序分型（polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT）法對廣東地區HCC患者血HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1基因多態性進行了分析，為從基因水平研究免疫遺傳因素在漢族人群HCC發病機制中的作用提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2012年6月～2015年12月 就診于解放軍第458醫院的廣州地區HBV感染后罹患HCC患者56例，男性53例，女性3例；年齡（51.38±10.21）歲。符合中華醫學會制定的原發性肝癌診療規范標準[12]，排除合并HCV或/和HIV感染者。另選在深圳血庫義務獻血的健康志愿捐獻者97例，男性86例，女性11例；年齡（49.71±12.34）歲，兩組間年齡和性別均無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 血清學檢測 采用ELISA法檢測HBsAg（北京萬泰生物藥業有限公司）；采用PCR法檢測HBV DNA（Light Cycler@480熒光定量 PCR儀和LightCycl er@480 SYBRGreen I Master試劑盒）。

1.3 血液HLA基因分型 抽取靜脈血，采用EDTA抗凝，抽取0.3 mL，使用Gentra DNA提取試劑（美國，Gentra）抽提DNA。采用 SBT法（美國Ariza公司試劑盒，即Atra Genetics AlleleSEQR HLA-A，-B、-C、-DQB1、-DRB1 SBT）分別擴增 HLA-A、B 等位基因第2、3和4外顯子、HLA-C和-DQB1基因第2和第3外顯子、HLA-DRB1基因第2外顯子，純化產物后，進行測序反應，使用ABI3730型序列分析儀進行毛細管電泳。應用Assign version 3.5版（Conexio Genomics，AppIecross，澳大利亞）軟件分析測序圖譜。

1.4 統計學方法 應用Arlequin統計軟件分析基因頻率，計算研究對象各檢測位點等位基因和基因型頻率，并驗證是否符合Hardy-Weinberg平衡，此處以P＜0.05作為Hardy-Weinberg不平衡的標準。應用Pearson卡方檢驗或連續校正卡方檢驗或Fisher精確概率法計算兩組人群基因頻率差異，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者與健康人血HLA-A等位基因的情況 HCC患者血HLA-A*02:03和A*02:07等位基因頻率明顯高于健康人（x2=5.167、x2=10.33，P=0.023、P=0.001）；HCC 患者血 HLA-A*30:01等 位基因頻率0.017857明顯低于健康人（x2=5.355，P=0.021，表 1）。

2.2 HCC患者與健康人血HLA-B等位基因頻率比較 HCC患者HLA-B*46:01等位基因頻率明顯高于健康人（x2=5.439，P=0.02）；HCC 患者 HLAB*13:02等位基因頻率明顯低于健康人（x2=6.702，P=0.01，表 2）。

2.3 HCC患者和健康人HLA-C等位基因頻率分析 兩組之間未見有明顯統計學差異的等位基因頻率，見表3。

2.4 HCC患者和健康人血HLA-DRB1等位基因頻率分析 HCC患者血HLA-DRB1*14:54等位基因頻率明顯高于健康人（x2=14.502，P=0.000）；HCC 患者血HLA-DRB1*12:02等位基因頻率明顯高于健康人（x2=4.761，P=0.029，表 4）。

2.5 HCC患者和健康人血HLA～DQB1等位基因頻率分析 HCC患者血HLA-DQB1*05:03等位基因頻率明顯高于健康人（x2=4.951，P=0.026，表 5）。

表1 HCC患者與健康人血HLA-A等位基因頻率比較

表2 HCC患者和健康人HLA-B等位基因頻數比較

表2 -續表

表3 HCC患者和健康人血HLA-C等位基因頻數比較

表3 -續表

表4 HCC患者與正常人血HLA-DRB1等位基因頻數比較

表5 HCC患者與正常人血HLA-DQB1等位基因頻數比較

3 討論

SBT技術無論在分型精確度、工作效率和自動化程度方面都明顯優于其它分型方法。在本研究中，我們采用SBT法首次對中國廣東地區HCC患者血 HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 高分辨等位基因進行了分型。

HLA基因復合體是迄今所知的人類最具有多態性的基因系統，依據編碼分子的不同特性而分成3類基因區，分別稱為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因。研究表明，腫瘤發生與機體免疫監控失調有關，HLA I類抗原與腫瘤的發生發展關系密切。經典的HLA I類分子包括HLA-A、B、C，幾乎分布于所有的有核細胞表面，是CD8+T淋巴細胞識別標志之一。HLA I類分子具有重要的免疫生物學功能：一方面HLA I類分子直接參與抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）對內源性抗原的加工和處理；另一方面，在T細胞抗原識別受體（T cell receptor，TCR）特異性識別APC遞呈的抗原肽過程中，必須同時識別抗原肽以及與抗原肽結合成復合物的HLA分子，才能產生激活T細胞的信號。HLA復合體通過參與抗原遞呈、制約免疫細胞間的相互作用、控制機體免疫應答的發生及強度等多個方面，參與免疫調節。盡管有在HCC組織和體外培養細胞中HLAⅠ類抗原表達增多的報道[13]，有關HLAⅠ等位基因與HCC發生的關系的研究報道非常少。Pan N et al在南京對中國東南地區人群的研究顯示[14]：A/11:01:01G、B/35:01:01G、B/58:01:01G和 C/03:02:01G是 HCC發生的易感基因，且B/35:01:01G顯示出12.04倍的HCC發生風險，與本研究發現并不一致。我們發現HLA-A*02:03、A*02:07、HLA-B*46:01 三個HLA-Ⅰ類等位基因在HCC人群表達遠高于正常健康人，提示 HLA-A*02:03、A*02:07、HLA-B*46:01 可能為HBV感染后罹患HCC的易感基因，這種差異可能與地區間的人群差異有關。

HLA II類基因的等位基因多態性導致了抗原結合槽及提呈抗原肽給T細胞的效率不同而決定著不同個體對免疫應答的差異。在II類區域中又以HLA-DRB1等位基因多態性最復雜，且是機體免疫基因（Ir）所在區域，故與免疫應答關系最為密切，并與許多疾病的遺傳易感性[15-19]相關。迄今，HLA II類等位基因與HCC病理以及遺傳易感性的關系已有較多闡明，本研究顯示，DRB1*14:54在HCC人群表達遠高于正常健康人，與之前的研究結果相符[20-22]，提示其為HBV感染后罹患HCC的易感基因，是乙型肝炎患者發展為HCC的危險因素，而DRB1*12:02在HCC人群的表達顯著高于正常對照，與Lin的研究也是符合的，可能是HCC的保護性因素。