肝細胞癌患者IL-18基因-137G/C和-607A/C位點單核苷酸多態性變化及其意義探討*

劉 晶，段 煒，張進生，楊海寧，孫 鵑，惠增騫

IL-18編碼基因位于第11號染色體（11q22.2-22.3）上，受上游具有啟動作用的基因位點的調控，IL-18兩個位點（-607A/C、-137G/C）的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）能夠調節IL-18基因的表達，從而影響疾病的進程[1-4]。當前，有關這兩個位點對IL-18基因表達的影響研究還主要集中在慢性乙型肝炎患者，而在HCC患者的研究報道結果不一[5]。本研究檢測了肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者外周血IL-18-607A/C和-137G/C兩個位點基因多態性，以探討其與HCC發生的關系，為預防和治療提供遺傳學理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年6月～2017年6月本院診治的HCC患者178例，男性92例，女性86例，年齡46～65歲，平均年齡（55.3±3.2）歲。依據原發性肝癌診療規范（2017年版）[6]，血清HBsAg陽性超過6個月，經臨床表現、血清甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）≥400μg/L、影像學和肝組織病理學檢查診斷。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②頑固性腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血或有肝性腦病史者；③合并肺、腎、心等功能嚴重障礙者；④對藥物過敏者；⑤精神疾病者。同時選擇健康人251例，男性130例，女性121例；年齡47～65歲，平均年齡（56.1±2.8）歲。兩組人群性別比例和年齡構成具有可比性（P＞0.05）。患者簽署知情同意書。

1.2 標本采集與檢測 抽取外周靜脈血2 ml，加入EDTA抗凝管中，混勻，使用人全血DNA提取試劑盒（上海生物工程有限公司）提取DNA，置于-80℃備用。采用聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）法行IL-18基因分型。IL-18-137G／C SNP位點的上游引物序列為5’-AATAAAGTGGCA GAGGATAC-3’，下游引物序列為 5’-ACAGAGCCC CAACTTTTACG-3’；IL-18-607A／CSNP 位點的上游引物序列為 5’-TGCTGTATCAGATGCAAGC-3’，下游引物序列為5’-CTCTCCCCAAGCTTACTTT C-3’。PCR反應體系為20 μl，其中基因組DNA l μl，緩沖液 2 μl，MgCl 0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq酶 0.2 μl，ddH20 12.2 μl，上、下游引物各 2 μl。PCR反應條件：95℃預變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火 90 s，65℃延伸 30 s，40 個循環；最后65℃延伸10 min。使用3730型DNA測序儀（美國ABI公司）檢測LDR熒光產物，應用Gene Mapper軟件分析結果。

1.3 統計學處理 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。采用t檢驗和x2檢驗比較年齡和性別等基線資料。采用擬和優度x2檢驗分析兩組SNP位點實際檢測的基因型頻率分布是否符合哈-溫（Hardy-Weinberg，HWE）平衡，P＞0.05被認為各基因型的分布符合HWE平衡。采用x2檢驗分析兩組基因型和等位基因頻率分布差異，以P＜0.05為差異具有統計學意義。采用非條件Logistic回歸分析OR值和95%可信區間（CI），以衡量基因型和等位基因與HCC發生的風險。

2 結果

2.1 兩組 IL-18-137G/C和-607A/C位點基因型和等位基因分布頻率比較 HCC患者IL-18-137G/C位點的GG基因型和G等位基因頻率顯著高于健康人（P＜0.05，表1）；HCC 患者 IL-18-607A/C 位點的AA基因型和A等位基因頻率顯著高于健康人（P＜0.05，表2），說明HCC患者GG基因型、G等位基因、AA基因型和A等位基因分布更多。

2.2 兩組IL-18-137G/C和-607A/C位點基因頻率比較 HCC組IL-18-137G/C位點的GG基因和G等位基因頻率顯著高于健康人（P＜0.05，表3）；HCC組IL-18-607A/C位點的AA基因和A等位基因頻率顯著高于健康人（P＜0.05，表4），提示攜帶IL-18-137G/C和IL-18-607A/C位點基因型和等位基因者罹患HCC的風險增加。

表1 兩組IL-18-137G/C位點基因型和等位基因分布頻率（%）比較

表2 兩組IL-18-607A/C位點基因型和等位基因分布頻率（%）比較

表3 兩組IL-18-137G/C位點基因頻率（%）比較

表4 兩組IL-18-607A/C位點基因頻率（%）比較

3 討論

IL-18屬于親炎癥因子，具有多功能性，能夠誘導IFN-γ的產生，所以也被叫做IFN-γ誘生因子，能夠促進NK細胞和Th1細胞作用，提高免疫反應能力，促進分IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等炎癥因子分泌，還能夠聚集中性粒細胞[6-8]。人類第11號染色體11q22.2-q22.3就是IL-18的基因編碼，其中研究最多的兩個SNP位點就是啟動子-137/-607[9]。研究顯示該基因活性受到-137G/C和-607C/A的影響，-607C→A的結果將阻斷cAMP與CREB結合，進而抑制CRE基因的轉錄[10-12]。-137由G變為C會阻斷H4 TF21核因子結合，進而阻斷其基因轉錄[13]。所以，IL-18與自身免疫性疾病等多種疾病有很大的關系。通過大量的數據分析發現，膀胱癌、腎細胞癌、胃癌和乳腺癌組織IL-18基因這兩個位點C基因突變增加[14]。

本研究結果顯示，HCC患者IL-18-37 G/C基因GG基因型和GC基因型分布頻率以及G等位基因和C等位基因分布頻率與健康人存在顯著差異（P＜0.05），HCC患者IL-18-607A/C位點AA基因型和A等位基因分布頻率顯著高于健康人（P＞0.05），提示攜帶IL-18-137G/C和IL-18-607A／C位點基因型和A等位基因者罹患HCC的風險增加。對IL-18-607A/C位點基因分型發現，慢性乙型肝炎患者攜帶IL-18 A等位基因者顯著高于慢性乙型肝炎康復者[15]，慢性乙型肝炎患者攜帶IL-18 A等位基因者也顯著高于健康人[16]，說明IL-18 A等位基因是感染HBV的危險基因，不利于機體清除HBV感染而導致感染慢性化，并可能有機會發展至HCC。

本研究結果還顯示，IL-18基因-137G/C和-607A/C位點基因型與HCC發生的關系，HCC患者IL-18位點GG基因型分布頻率顯著高于健康人（P＜0.05），G等位基因分布頻率顯著高于健康人（P＜0.05），HCC 患者 IL-18基因 -607A/C 位點 AA基因型分布頻率顯著高于健康人，（P＜0.05），A等位基因分布頻率也顯著高于健康人（P＜0.05）。同樣地，有學者在巴西人群進行IL-18-607A/C及-137G/C兩個位點的研究發現，原發性肝癌患者IL-18-607A/C位點AA基因型和A等位基因分布頻率顯著高于健康人，但是在兩組之間IL-18-137G/C位點基因多態性無統計學差異，提示僅IL-18-607A/C位點AA基因型和A等位基因是原發性肝癌的易感基因，而IL-18-137G/C位點不屬于易感基因[17、18]。另有研究顯示IL-18-607A/C位點基因多態性與肝癌發生無關[19]，甚至有發現攜帶IL-18 GC基因型和C等位基因者肝癌發生率低，只有-607A/C位點CC基因型分布在PLC患者比較高，而并未發現其他的基因型或等位基因[20]。或許只有當攜帶IL-18-137G/C位點易感基因和慢性HBV感染同時存在時，才可能容易發展至肝癌，而關聯基因型可能并不一致，具體原因還有待進一步研究。學者們懷疑可能是只有當IL-18基因在G→C突變的時候，突變過程導致基因轉錄活性降低，才可能抑制細胞轉化過程。

綜上所述，通過本研究，我們推測慢性HBV感染者發生IL-18-137G/C位點GG基因型和G等位基因，或-607A/C位點AA基因型和A等位基因突變時，轉錄基因活性降低，導致血清IL-18分泌減少，使機體免疫力和抗腫瘤能力降低，從而導致感染慢性化和增加肝癌發生的可能[21-23]。