慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血IFN-γ基因多態性分析及其臨床意義探討*

王燕，吳琦琦，莊小芳，馬燕，郭峰，王曉波，王曉忠

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是一種公認的致命性肝病癥候群，其特征在于肝功能急性失代償（acute decompensation，AD），導致肝、腎、腦等器官功能衰竭，生存率低（28 d病死率為30%～40%）[1]。盡管臨床引入了人工肝支持系統和抗病毒治療，但是除非進行肝移植，ACLF患者短期預后仍然很差[2]。該病發病機制復雜，目前尚不完全明確，但多數學者認為在HBV感染導致的ACLF發病過程中免疫損傷起到了關鍵的作用[3]。細胞因子是體液免疫的重要介質，在HBV感染性疾病的發病過程中發揮了重要的作用。γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）是由活化的炎癥細胞產生的多效能的促炎性細胞因子[4]，具有抗病毒、抗增殖和免疫調節作用。同時，IFN-γ可誘導肝細胞凋亡或抑制肝細胞周期進程[5]。IFN-γ基因位于染色體12q24上，跨度約為5.4 kb，由四個外顯子、三個內含子組成[6]，與免疫應答機制的啟動和調節關系密切。 IFN-γ基因多態性可通過影響IFN-γ的轉錄、翻譯和表達過程，導致不同個體IFN-γ的產量及宿主免疫功能的差異，從而影響HBV攜帶者的不同臨床轉歸。IFN-γ的第一個內含子中+874 T/A（rs567588525）位點 TT基因型產生高水平IFN-γ，有助于宿主對病毒感染的防御。相反，基因型TA和AA導致IFN-γ產生水平低，可能增加了病毒感染的風險。此外，含有+874T/A和 +2109A/G（rs34066384）的 DNA序列是 NF-κB轉錄因子的特異性結合位點，直接影響IFN-γ表達量。如果該通路受到影響，可能會導致氧化損傷[7]。我們分析了HBV感染導致的ACLF患者IFN-γ基因多態性與發病和臨床結局的關系，以探討IFN-γ基因+874位點和+2109位點基因多態性在本病發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年1月～2017年2月在新疆醫科大學附屬中醫醫院住院的由HBV感染導致的ACLF患者51例，男性37例，女性14例；年齡23～75（49±2）歲。嚴格按照《肝衰竭診治指南（2012年版）》的標準診斷[8]：即①極度乏力，有明顯的消化道癥狀；②黃疸迅速加深，血清總膽紅素（TBIL）大于正常值上限10倍或每日上升≥17.1 μmol/L；③出血傾向明顯，PTA≤40%（或INR≥1.5），并排除其他原因導致的凝血功能障礙者。排除合并原發性肝癌、妊娠、肝移植者、有嚴重心肺腎功能不全及其他惡性腫瘤患者。另選在我院體檢的健康人50例，男性30例，女性20例；平均年齡48±2（24～72）歲，既往無肝炎病史，血清肝炎病毒標志物均陰性，HBV DNA陰性，肝功能正常。

1.2 單核苷酸多態性（SNP）分型檢測 本實驗采用SNaPshot SNP分型技術對101個樣本進行2個SNP位點分型。 設計了兩對PCR引物用于擴增包含2個位點的2個150～350 bp片段，設計了2個緊鄰的SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸（+874位點引物，上游引物（F）：5’-TCTGGCTTAGG TATCATAA-3’，下游引物（R）：5’-GG CTTCATAAAATGAGGG-3’。+2109 位點引物，F：5’-GCAAATG ATTTCTCTCAGC-3’，R：5’-GGAATGAGACAGGTGAGAT-3’）。引物用在線（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）Primer3軟件設計。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經蝦堿酶（SAP，from Promega）和外切酶 I（EXO I，from Epicentre）純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用SAP（from Promega）純化后，在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）進行分析（以上實驗過程由SNP試驗公司完成）。

1.3 統計方法 應用 SPSS 23.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗或方差分析；計數資料采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACLF患者入院時肝功能指標變化 入院時，ACLF患者 ALT為 506.07±709.63 U/L，AST為504.66±623.21 U/L，AKP 為 196.13±219.62 U/L，GGT為121.45±121.07 U/L，TBIL為267.07±144.06 μmol/L，ChE 為 3136.32±2682.00 U/L，ALB 為29.59±5.59 g/L，TG 為 1.81±1.50 mmol/L，TC 為1.39±1.52 mmol/L，GLU 為 5.90±2.15 mmol/L，BUN為 8.06±8.31 mmol/L，Cr為 103.35±99.80 μmol/L，PLT為（113.62±64.42）×109/L，PT 為 23.96±7.41 s，PTA為32.04±10.86%，FIB為1.67±0.80 g/L。

2.2 兩組血IFN-γ基因兩個位點多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗結果比較 經Hardy-weinberg遺傳平衡定律檢驗，ACLF患者+874位點和+2109位點的實際數與理論數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明各基因頻率已達到遺傳平衡，具有群體代表性（表1）。

2.3 兩組IFN-γ基因+874位點T/A等位基因及基因型分布頻率比較 ACLF患者+874位點TA+AA基因型頻率顯著高于健康人（P＜0.05），提示TA+AA基因型患ACLF的風險是TT基因型的2.363倍（OR=2.363，95%CI：1.057～5.281）；+874 位點 A 等位基因頻率顯著高于健康人（P＜0.05），提示A等位基因患ACLF的風險是T等位基因的2.195倍（OR=2.195，95%CI：1.182～4.076，表 2）。

2.4 兩組IFN-γ基因+2109位點A/G等位基因及基因型分布頻率比較 ACLF組+2109位點AG+GG型基因型頻率顯著高于健康人（P＜0.05），提示AG+GG基因型患ACLF的風險是AA基因型的2.96倍；G等位基因型顯著高于健康人，提示G等位基因患ACLF的風險是A等位基因的2.51倍（表3）。

表1 兩組血IFN-γ基因兩個位點多態性Hardy-Weinberg平衡檢驗結果（%）比較

表2 兩組血IFN-γ基因+874位點T/A等位基因和基因型分布頻率（%）比較

表3 IFN-γ基因+2109位點A/G等位基因及基因型分布頻率（%）比較

2.5 不同IFN-γ基因型ACLF患者Child-Pugh評分和MELD評分比較 依據患者入院后的首次實驗室檢測結果，計算患者Child-Pugh評分和MELD評分。結果顯示，IFN-γ基因+874位點與+2109位點各基因型間Child-Pugh評分和MELD評分均無統計學差異（P＞0.05，表 4、表 5）。

2.6 不同臨床結局ACLF患者血IFN-γ基因+874位點和+2109位點等位基因和基因型分布頻率比較 在治療3個月末，ACLF患者生存28例，死亡23例（45.1%）。兩組IFN-γ基因+874位點、+2109位點基因型及等位基因分布頻率均無顯著性差異（P＞0.05，表 6、表 7）。

表4 不同IFN-γ基因+874位點基因型ACLF患者兩項評分（±s）比較

表4 不同IFN-γ基因+874位點基因型ACLF患者兩項評分（±s）比較

IFN-γ基因+874位點基因型（n=51）TT（n=23） TA（n=17） AA（n=11）Child 評分 11.04±1.692 10.88±1.536 11.45±1.293 MELD 評分 26.00±4.796 24.53±4.810 27.36±6.153 F 0.457 1.057 P 0.636 0.355

表5 不同IFN-γ基因+2109位點基因型ACLF患者兩項評分（±s）比較

表5 不同IFN-γ基因+2109位點基因型ACLF患者兩項評分（±s）比較

IFN-γ基因+2109位點基因型（n=51）AA（n=25） AG（n=19） GG（n=7）Child 評分 10.80±1.291 11.21±1.843 11.71±1.496 MELD評分 25.44±5.723 26.42±4.426 25.43±5.159 F 1.044 0.088 P 0.360 0.916

表6 兩組ACLF患者IFN-γ基因+874位點T/A等位基因及基因型分布頻率（%）比較

表7 兩組ACLF患者IFN-γ基因+2109位點A/G等位基因及基因型分布頻率（%）比較

3 討論

HBV感染已被確定為亞太地區ACLF的主要病因[9]。ACLF是慢性乙型肝炎（CHB）患者短期病死率升高的主要因素。HBV感染后的表現是由病毒和宿主的相互作用決定的，細胞介導的免疫反應參與病毒的清除以及在此期間的疾病發病過程，細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-10，腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α），IFN-γ 等與 ACLF 患者疾病臨床預后和肝細胞壞死密切相關[10]。其中輔助性T淋巴細胞分泌的IFN-γ在誘導病毒清除方面發揮重要的作用[11]。IFN-γ作為抗原提呈細胞和淋巴細胞增殖、分化的調節劑，參與細胞炎癥反應和抗病毒免疫，高表達量的IFN-γ對病毒的清除有重要作用。在宿主早期特異性防御階段，IFN-γ釋放增加T細胞的細胞毒性和自然殺傷細胞活性，增強細胞免疫應答。在隨后的抗原特異性免疫應答階段，IFN-γ可作為抗原呈遞、增殖以及淋巴細胞分化的調節劑[12]。IFN-γ各位點基因多態性可以影響IFN-γ表達，并以此方式影響免疫應答過程[13]。

本研究對新疆地區51例ACLF患者和50例健康人血IFN-γ基因+874位點和+2109位點多態性進行了分析。結果顯示ACLF組TA+AA基因型頻率（54.9%）顯著高于健康人（24.0%），提示TA+AA基因型患ACLF的風險比TT基因型高2.365倍。同時，T/A等位基因分布頻率在ACLF（T：61.8%，A：38.2%）和健康人（T：78.0%，A：22.0%）間有明顯的差異，A等位基因患ACLF的風險是T等位基因的2.195倍，表明A等位基因和基因型是ACLF的遺傳易感基因。健康人T等位基因和基因型頻率顯著高于ACLF組，由于T等位基因與IFN-γ的產量增加相關，從而使宿主免受疾病的侵擾[14，15]。

+2109位點位于IFN-γ基因的第3內含子區，此區的多態性能夠調節核因子與IFN-γ基因的結合，從而可能會影響IFN-γ mRNA表達水平[15]。在AA、AG、GG 基因型中，GG基因型是慢性活動性肝病的易感基因型。本研究結果顯示，AA、AG+GG基因型頻率在ACLF患者（49.0%，51.0%）和健康人（74.0%，26.0%）之間有明顯的差異，提示AG+GG基因型人群患HBV-ACL F的風險是AA基因型的2.96倍。ACLF組G等位基因頻率（32.4%）顯著高于健康人（16.0%），提示攜帶G等位基因的人群患ACLF的風險是A等位基因的2.511倍，IFN-γ+2109位點G基因型和等位基因可能影響機體免疫抗病毒過程。但尚不清楚+2109位點基因多態性的A至G轉換是如何影響IFN-γ基因轉錄的[16]。

研究表明，IFN-γ可以促進細胞吞噬、促使病原體被殺滅、干擾病毒生長，是肝臟免疫病理損傷的重要效應分子。在ACLF患者，血清IFN-γ水平高于慢性乙型肝炎患者和正常人群[17]。由于I型干擾素（IFNs）主要由樹突狀細胞（DC）產生，DCs的數量和功能與ACLF患者的預后密切相關。所以，在ACLF發病初期IFN-γ呈高水平表達，經過治療后IFN-γ水平降低，IFN-γ水平與病情進展和預后呈正相關關系[18]。本研究比較了ACLF患者三個月的臨床結局，結果顯示，IFN-γ基因多態性與患者臨床結局差異無統計學意義。由于肝衰竭發生和發展是由多因素參與的一個復雜過程，病情發展過程變化迅速。既往研究提示肝衰竭進展至中晚期時，常常合并多種并發癥，且并發癥間可相互影響，從而加重肝衰竭患者病情進展，進一步增加了死亡的風險。本研究僅用入院后第一次的實驗室數據進行肝衰竭預后評分，分析預后評分與IFN-γ基因多態性的關系，尚缺乏對疾病預后的動態性預測，因此其可靠性受到了影響。

由于 IFN-γ基因還存在其他位點的SNP，且這些多態性與 IFN-γ表達和分泌的關系還不明確。同時，ACLF的臨床表現復雜多變，受基因、機體免疫和環境因素共同作用的影響。IFN-γ基因多態性與 HBV ACLF發病的關系及該位點不同基因型與其他細胞因子的相互作用，還需要更深入的研究。