綜合基因表達譜分析與人類肝胰島素抵抗相關蛋白分子表達研究*

黃發(fā)光，李小成，龔建平，李澤民

胰島素的主要作用是調節(jié)機體血糖平衡和循環(huán)游離脂肪酸濃度。胰島素抵抗是指其作用的靶器官（主要是脂肪組織、肝臟和肌肉）對胰島素的敏感性降低，主要表現為骨骼肌和脂肪組織不能攝取足夠的葡萄糖，同時肝臟合成的葡萄糖增多，胰島素抵抗可增加循環(huán)游離脂肪酸濃度和導致異位脂肪累積。近年來，越來越多的研究表明肥胖與胰島素抵抗之間存在因果關系[1]。肥胖是一種迅速增長的全球健康問題，通過增加關鍵組織或器官內的脂質積累，而引起代謝功能障礙和胰島素抵抗。富含飽和脂肪酸的飲食可加劇肥胖癥和肝脂肪變性，從而增加胰島素抵抗和2型糖尿病（T2DM）的發(fā)生風險[2]。研究觀察到肥胖和T2DM患者非酯化脂肪酸（NEFAs）增加與胰島素抵抗有關[3]，故認為NEFAs的釋放是誘導胰島素抵抗和損害β細胞功能的一個重要因素。另外，在肥胖癥和T2DM患者，視黃醇結合蛋白4（RBP4）也可誘導胰島素抵抗的產生，主要是通過減少肌肉組織磷脂酰肌醇3羥激酶【PI（3）K】信號傳導和通過視黃醇依賴性機制增強肝臟葡萄糖源性磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表達來實現[4]。Bohan[5]首次發(fā)現了糖尿病和肝硬化之間的關系，除了過度飲食、肥胖和缺乏運動外，慢性肝病也是導致高胰島素血癥的重要原因[6]。研究發(fā)現慢性肝病所致的糖尿病患者血清胰島素水平高于因生活方式不良引起的相關糖尿病患者[7]。在慢性肝病患者，各種致病因素均可能參與了胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展[8]，但胰島素抵抗的發(fā)生機制及肝臟在胰島素抵抗發(fā)生過程中的作用至今尚未完全闡明。本研究通過生物信息學方法分析人類肝組織胰島素抵抗相關基因的表達差異，基于基因表達譜數據構建蛋白相互作用網絡，篩選出有潛在調控作用的關鍵蛋白分子，以探索肝臟對胰島素抵抗可能的調控信號通路。

1 資料與方法

1.1 基因表達譜數據的獲得 從公共可獲得的基因表達集（GEO）NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索符合本研究的基因芯片數據。下載來源于人類胰島素抵抗肝臟組織的基因表達譜數據集GSE23343[9]，芯片分析平臺為GPL570（HG-U133-Plus-2）Affymetrix表達譜芯片。GSE23343數據集來源于日本金澤大學醫(yī)學院，用于分析的人群包括10例2型糖尿病和7例血糖正常人的肝臟組織，通過經皮肝穿刺活組織檢查獲取肝臟組織，隨后立即在液氮中冷凍和-80℃保存，直至使用。

1.2 差異基因表達譜分析 將下載的CEL格式原始數據上傳至Gene-Cloud Biotechnology Information（GCBI, http://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index） 網站，進行差異基因分析。基因表達值為計量資料，2型糖尿病肝組織與正常對照肝組織之間的基因表達水平差異比較采用t檢驗，P值＜0.05、Q值＜0.05和差異倍數（fold change）＞1.2被設置為截止值，以濾除差異表達基因（DEGs）。

1.3 功能信號通路富集分析 基因本體論（gene ontology，GO）富集分析已經成為基因組或轉錄組數據大規(guī)模功能研究的常用方法[10]，注釋、可視化和整合發(fā)現的數據庫（DAVID，http://david.niaid.nih.gov）由一個集成的生物知識庫和功能注釋圖表或表組成。該數據庫為研究者提供了一套全面的功能注釋工具，以整合特定功能的顯著基因[11]。KEGG數據庫（http://www.kegg.jp/）由生物化學途徑的圖形圖表組成，包括大多數已知的代謝途徑和調節(jié)途徑[12]。我們利用DAVID在線工具對上調或下調基因進行GO生物過程功能富集和KEGG通路富集分析。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 蛋白質-蛋白質相互作用網絡提供了許多有價值的信息，以了解細胞功能和生物過程。許多研究已經顯示，在相同的相互作用中的蛋白質，即它們在構建的蛋白質-蛋白質相互作用網絡中是相鄰的，并具有一些共同的特征[13，14]。在本研究中，蛋白質-蛋白質相互作用網絡是基于從STRING檢索的蛋白質相互作用的信息（用于檢索互作基因/蛋白質的搜索工具，http://www.string-db.org/）[15]。

2 結果

2.1 胰島素抵抗與正常肝組織差異表達基因 通過對下載的數據集GSE23343進行分析，總共獲得928個上調差異基因。差異基因表達譜宏觀表象見圖1。

2.2 差異基因功能通路富集分析 為了研究肝胰島素抵抗基因在分子生物功能水平的表達情況，將篩選出的928個差異基因映射到GO數據庫，GO生物過程富集發(fā)現差異基因主要富集在cellular process（FDR＜0.05，P=1.94-5）生物過程中（如表1）。KEGG通路富集分析表明差異基因主要富集在7條信號通路中（表2），包括兩大類，即腫瘤相關通路（腎細胞癌、膠質瘤和非小細胞肺癌）和信號轉導通路。

圖1 胰島素抵抗差異基因表達譜火山圖 縱軸代表對P值取-log10，橫軸代表對Fold-Chang取log2，右上角紅色部分為上調的差異基因，藍色部分為無統計學差異基因

表1 差異表達基因GO富集分析結果

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建可確定各差異表達基因/蛋白之間的相互作用關系。將928個肝胰島素抵抗差異基因上傳到String在線工具，得到差異蛋白相互作用網絡圖（圖2），包括411個圓點，代表差異基因/蛋白，643條線表示相互作用關系，且每條線代表的關系均有相應的實驗證明。無相互作用的基因/蛋白則被剔除。最終選出5個核心蛋白，即MDM2、PCNA、CAV1、PIK3R1、NR3C1。這些基因 /蛋白在蛋白質-蛋白質相互作用網絡中與周圍蛋白關系最密切，連線最多。可能在糖尿病患者肝臟組織中與胰島素抵抗的產生相關。然后，從String網站下載蛋白質-蛋白質相互作用網絡中相互作用點的坐標信息和相互作用關系文檔，利用Viacomplex軟件構建胰島素抵抗差異基因/蛋白質相互作用的景觀圖，從宏觀上可看出這些差異基因均為上調基因（圖3）。

表2 差異表達基因KEGG通路富集分析結果

圖2 蛋白質-蛋白質相互作用網絡

圖3 胰島素抵抗差異基因/蛋白質相互作用的拓撲表示（景觀分析）

3 討論

胰島素抵抗與高胰島素血癥、異常脂蛋白血癥、高血壓和幾種非傳統危險因素的異常（如內皮功能障礙、異常纖維蛋白溶解和炎癥）相關[16]。既往研究表明肝臟可通過產生分泌蛋白來調節(jié)外周組織對胰島素的敏感性或耐受性[9]，從而調節(jié)糖代謝平衡。另外，也有研究確定硒蛋白P（SeP）是一種由SEPP1基因編碼的肝源性分泌蛋白，SeP在調節(jié)葡萄糖代謝和胰島素敏感性中的作用已得到證實，并認為SeP可作為2型糖尿病一種潛在的治療靶點[17，18]。但盡管許多實驗已經闡述了胰島素抵抗的發(fā)生機制，但尚無統一的定論，特別是肝臟在胰島素抵抗中的作用無明確的實驗論證。

本研究運用生物信息學方法，分析2型糖尿病患者與正常肝臟組織基因表達譜數據，識別胰島素抵抗肝組織中的差異表達基因，進一步構建蛋白-蛋白相互作用網絡，獲取了5個關鍵基因/蛋白質，這些蛋白可能在肝胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用。既往研究表明，MDM2可參與CRY1介導的FOXO1降解，CRY1與FOXO1和MDM2可形成蛋白復合物，刺激FOXO1泛素化和降解，且在缺少MDM2的情況下使CRY1介導的FOXO1降解減弱[19]，而FOXO1是一種刺激糖原生成基因表達的關鍵轉錄激活因子[20]。FOXO1的降解可導致糖原生成減少，從而引起血糖升高。故我們可推測MDM2通過作用于FOXO1而與肝胰島素抵抗的產生相關，具體調控機制有待進一步研究。

人類相關實驗中未見PCNA與胰島素抵抗及糖尿病相關的報道。在動物實驗研究中顯示，高脂飲食大鼠的血管周圍脂肪組織中檢測到PCNA表達，而這些大鼠表現有明顯的胰島素抵抗、高血糖癥和高脂血癥等[21]。在一項有機錫化合物誘導胰島素抵抗和糖尿病的動物實驗中發(fā)現，PCNA陽性細胞的百分比在胰島素抵抗小鼠胰島中顯著減少，小鼠體內糖平衡被破壞[22]。PCNA與胰島素抵抗可能相關，但相關關系尚不明確。

CAV1在胰島素抵抗產生中的作用已被大量實驗證明[23-25]，并有研究指出CAV1基因的變異與胰島素抵抗和高血壓相關，CAV1基因多態(tài)性可作為胰島素抵抗和和高血壓早期檢測的生物標志物[25]。肥胖相關的胰島素抵抗與脂肪肝、血脂異常和低血漿脂聯素相關。最近研究報告在5例有PIK3R1基因C終端突變的患者中，4例存在重度胰島素抵抗[26]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路是胰島素和許多生長因子作用的中心。已經在患有SHORT綜合征（以身材矮小，部分性脂肪營養(yǎng)不良和胰島素抵抗為特征的疾病）患者中鑒定了編碼PI3K的p85α調節(jié)亞基（PIK3R1）的基因存在雜合突變[27]。實驗研究表明全身胰島素抵抗與胰島素和其他生長因子在肝、肌肉和脂肪中激活PI3K的能力降低相關[28]。NR3C1為糖皮質激素受體，與代謝綜合征有關[29]，但未見與胰島素抵抗相關的報道。

綜上所述，本研究識別出的5個關鍵蛋白分子（MDM2、PCNA、CAV1、PIK3R1、NR3C1）可能在肝胰島素抵抗中起到重要作用。基于基因芯片大數據分析進一步驗證了先前實驗研究發(fā)現的與胰島素抵抗相關的部分蛋白分子。另外，也第一次提出了幾個與人類肝臟組織胰島素抵抗相關的新蛋白。今后可對這些候選基因實施進一步的基因表達驗證和功能機制研究，以探索肝胰島素抵抗產生的相關機制，為研制新的控制血糖藥物提供潛在的作用靶點。