血清IL-17水平及其基因多態(tài)性與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系研究*

何 勝，張 震

白細(xì)胞介素（IL）-17是促炎細(xì)胞因子，與多種炎性疾病的發(fā)生有關(guān)[1-4]。有報(bào)道稱(chēng)IL-17可以激活其他細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而致病[5-7]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17具有抗病毒作用[8]。本研究探討了血清IL-17水平及其基因 IL-17-197A/G位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，旨在為HBV感染的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2015年3月～2017年8月在我院就診的自限性HBV感染者80例，無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者60例，慢性乙型肝炎患者120例，乙型肝炎肝硬化患者40例。符合慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者為血清HBsAg陽(yáng)性，1年內(nèi)隨訪(fǎng)3次以上，每次間隔至少3個(gè)月，血清ALT水平均正常；自限性HBV感染者為無(wú)急慢性乙型肝炎病史，未接種過(guò)乙肝疫苗，血清抗-HBs和 /或抗 -HBc或抗 -HBe陽(yáng)性，HBsAg和HBeAg陰性，肝功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等其他嗜肝病毒感染；2）酒精性肝病、代謝性肝病、自身免疫性肝病等。本研究已經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法 采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17水平[10]（武漢博士德生物有限公司，使用美國(guó)伯騰儀器有限公司生產(chǎn)的SynergyH4酶標(biāo)儀，在490 nm波長(zhǎng)下讀取OD值，并計(jì)算IL-17水平）；使用全自動(dòng)生化分析儀（AU5800，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用PCR法檢測(cè)血清HBV DNA水平（廣州達(dá)安公司，使用美國(guó)賽默飛有限公司提供的DA7600型PCR分析儀）。

1.3 血清IL-17等位基因和基因頻率檢測(cè) 使用DNA提取試劑盒（中國(guó)東盛生物有限公司）提取總DNA，采用PCR法檢測(cè)IL-17-197G/A位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。引物由北京安必奇生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，上游引物為5’-AACAAGTAAGAATG AAAAGAGGACATGGT-3’，下游引物為 5’-CCCCC AATGAGGTCATAGAAGAATC-3’。擴(kuò)增條件為：90℃變性 10 min，60℃退火 1 min，循環(huán) 35次，72℃延伸10 min。使用單核苷酸檢測(cè)試劑盒（北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司）檢測(cè)，全自動(dòng)檢測(cè)分析三個(gè)位點(diǎn)（AA、AG、GG）的基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究資料均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以（±s）表示，血清IL-17水平的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD方法，組間單核苷酸位點(diǎn)等位基因和基因多態(tài)性的分布頻率比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IL-17水平比較 乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平顯著高于慢性乙型肝炎組、無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者組和自限性HBV感染者組（F3，296=102.8，P 均＜0.05）；慢性乙型肝炎組血清IL-17水平顯著高于無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者組和自限性HBV感染者組（P均＜0.05，圖1）。

2.2 慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化血清IL-17水平分層比較 在乙型肝炎肝硬化組，血清高HBV DNA載量組（＞1×105copies/mL）血清IL-7水平更高（t=5.1，P＜0.05），血清 ALT＞40 U/L 組血清 IL-7水平更高（t=10.7，P＜0.05）；在慢性乙型肝炎組和乙型肝炎肝硬化組，血清AST＞40 U/L組血清IL-7水平更高 （t=24.5，P＜0.05；t=22.4，P＜0.05），血清TBIL＞20 μmol/L組血清 IL-7水平更高（t=7.3，P＜0.05；t=12.8，P＜0.05，表 1）。

圖1 各組血清IL-17水平比較

2.3 各組血清IL-17-197A/G位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較 乙型肝炎肝硬化組IL-17-197 AA基因型和A等位基因分布頻率最高，慢性乙型肝炎組GG基因型和G等位基因分布頻率最高，HBV攜帶者組AA基因型和A等位基因分布最高，自限性HBV感染GG基因型和G等位基因分布最高（表2）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平最高，無(wú)癥狀慢性HBV攜帶者和自限性HBV感染者血清IL-17水平較低。乙型肝炎肝硬化IL-17-197 AA基因型分布頻率高，占75.0%；自限性HBV感染AA基因型的分布頻率低，占10.0%，GG基因型分布頻率高，占75%。乙型肝炎肝硬化A等位基因的分布頻率高，占57.5%；自限性HBV感染A等位基因的分布頻率低，占20.0%，G等位基因分布頻率高，占80.0%，說(shuō)明AA基因型和A等位基因增加了HBV感染的不良轉(zhuǎn)歸。

表1 不同指標(biāo)水平慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平（ng/m l,±s）的比較

表1 不同指標(biāo)水平慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平（ng/m l,±s）的比較

①P＜0.05

例數(shù) 慢性乙型肝炎（n=120） 例數(shù) 乙型肝炎肝硬化（n=40）HBV DNA（copies/mL） ≤1×105 32 4.2±0.4 26 6.0±0.3＞1×105 88 4.1±0.3 14 6.8±0.5①ALT（U/L） ≤40 51 3.7±0.4 22 4.8±0.5＞40 69 3.6±0.3 18 6.9±0.7①AST（U/L） ≤40 35 4.0±0.1 25 6.2±0.5＞40 85 4.9±0.3① 15 8.9±0.4①TBIL（μmol/L） ≤20 40 3.5±0.5 26 4.5±0.5＞20 80 4.1±0.2① 14 6.9±0.6①

表2 各組IL-17-197A/G 位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率（%）的比較

IL-17是在小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）雜交瘤中分離出來(lái)的CTLA-8的cDNA序列，是一種新型細(xì)胞因子家族，參與了機(jī)體炎癥和免疫防御過(guò)程，與自身免疫性疾病密切相關(guān)[11，12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在胞外菌感染過(guò)程中，多種不同病原體可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-17，IL-17進(jìn)一步又可刺激IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生[13-15]。有報(bào)道稱(chēng)，慢性乙型肝炎患者外周血IL-17水平均升高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10水平下降[16]。結(jié)果表明，IL-17在HBV感染和病毒慢性化進(jìn)程中起到重要作用，結(jié)果與有關(guān)研究一致[17，18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，病毒性肝炎進(jìn)展為肝硬化與感染的抗原量無(wú)關(guān)，但是與病毒毒力和肝功能損傷程度有關(guān)[19]。我們根據(jù)HBV DNA載量的高低將慢性乙型肝炎組和乙型肝炎肝硬化組進(jìn)一步分為HBV DNA載量≤1×105copies/mL和＞1×105copies/mL兩個(gè)亞組，并根據(jù)肝功能指標(biāo)的高低進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化組高病毒載量組人群血清IL-7水平更高，血清ALT＞40 U/L組血清IL-7水平也更高；在慢性乙型肝炎組和乙型肝炎肝硬化組，血清ALT＞40 U/L組血清IL-7水平升高，TBIL＞20 μmol/L組血清IL-7水平升高。

對(duì)IL-17基因多態(tài)性分析顯示，肝硬化患者IL-17-197 AA、AG和GG基因型分別為75.0%、10.0%和15.0%，等位基因A分布頻率為57.5%，G分布頻率為42.5%，而慢性乙型肝炎患者則分別為25.8%、16.7%、57.5%和34.2%、65.8%，組間差異顯著（P＜0.05），乙型肝炎肝硬化組以 IL-17-197 AA基因型和A等位基因分布頻率為主，慢性乙型肝炎組以GG基因型和G等位基因分布頻率為主，HBV攜帶者組以AA基因型和A等位基因分布為主，自限性HBV感染者以GG基因型和G等位基因分布為主。慢性HBV感染后對(duì)病毒的清除能力在不同人群因遺傳背景不同而有高低之分。AA基因型分布頻率與血清IL-17水平趨勢(shì)相似，IL-17A/G AA基因型和A等位基因可能增加了HBV感染的不良轉(zhuǎn)歸。研究[20]發(fā)現(xiàn)IL-17基因多態(tài)性與慢性HBV感染有關(guān)，并且AA基因會(huì)增加慢性乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究的局限性有以下幾個(gè)方面：1）本研究為單中心研究，未考慮不同人種和區(qū)域的差異；2）樣本量較小，結(jié)果可能會(huì)有所偏倚。