蝦青素對肝纖維化大鼠的保護作用及機制研究*

劉恩強，陳果，廖修用，許美鳳，魏貴玉，羅小平

肝纖維化的病理機制為肝組織膠原蛋白等細胞外基質的合成與降解失衡，導致膠原纖維沉積[1，2]。肝纖維化為肝硬化的必經階段，并可能發展為肝癌[3，4]。大量研究表明，肝星狀細胞的活化為肝纖維化的關鍵步驟，轉化生長因子（TGF）-β1/Smad通路和ERK通路對肝星狀細胞活化具有調節作用[5，6]。本課題組前期研究證明，蝦青素對大鼠肝纖維化過程具有抑制作用，但其抑制機制并未明確。本研究探討了蝦青素是否通過調節TGF-β1/Smad通路或ERK通路抑制了肝纖維化的發生。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 雄性SD大鼠，體質量180～220 g，購自河北醫科大學實驗動物中心。動物喂養及處理均符合《關于善待實驗動物的指導性意見》和《實驗動物倫理學》的相關規定。本實驗經我院動物醫學倫理委員會批準。蝦青素（astaxanthin，阿拉丁）和秋水仙堿（吉林紫鑫藥業股份有限公司，批號 110809）；四氯化碳（CCl4，淄博暢榮化工，批號120708）；兔抗鼠轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、抗Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、抗Smad2單克隆抗體（美國，Abcam 公司，批號為 ab224492、ab80424、Q16795 和G3507）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京索萊寶）；10%甲醛固定液（上海歌凡）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司）。低溫高速離心機（美國Thermo公司）；光學顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）；Line Gene9600實時熒光定量PCR儀（北京中科盟科技有限公司）；DYCZ-40K電泳儀、DYCZ-40G電泳槽和DYCZ轉模儀（北京六一儀器廠）。

1.2 模型制備[7]將SD大鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組（0.1 mg·kg-1）、蝦青素Ⅰ組（2 mg·kg-1）和蝦青素Ⅱ組（4 mg·kg-1），每組 10 只。除正常組外，其余各組經大鼠背部皮下注射50%CCl4（1.0 ml·kg-1），每周 2次，持續 10 w。給予正常組同等劑量的花生油，在造模后第6 w，分別給予各組大鼠相應藥物灌胃，1次/d，共6 w。在最后一次灌胃后，禁食12 h，處死動物。取肝組織，置于10%甲醛溶液中固定后切片，行HE和馬松（Masson）染色，光鏡下觀察肝組織損傷和膠原纖維增生程度。采用Metavir分級法評價肝纖維化分期（S1～S4）[8]。

1.3 大鼠肝組織 CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1 和p-ERK蛋白表達檢測 采用Western blot法，取適量大鼠肝組織，加Trizol裂解液和PMSE（100:1）裂解肝組織35 min，4℃ 4000 r/m離心20 min。取上清液，置于-20℃冰箱保存。采用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。使用Image J軟件測定條帶IOD值。

1.4 大鼠肝組織 CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1 和p-ERK mRNA檢測 采用RT-PCR法，用液氮研磨肝臟組織，加入Trizol溶液提取總RNA。經核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對提取的RNA進行分析。取總RNA 4 μL，82℃水浴5 min，加入反轉錄反應液，44℃孵育60 min，留取產物待測。擴增參數，95℃10 min，60℃50 s,72℃延伸 50 s，72℃最終延伸 10 min，10℃最終保存。基因水平分析采用2-△Ct法測定相對含量，將β-actin設為內參，取Ct值。計算公式為△Ct=Ct（目的基因）-Ct（β-actin）。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統計學分析 應用SPSS 19.0統計學軟件處理，對服從正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比價采用LSD-t檢驗。等級資料的比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝纖維化分期比較 與模型組比，應用蝦青素干預后，肝纖維化S3期減少，S2期增多（表2），但兩種劑量的蝦青素干預組無顯著性相差（P＞0.05）。

表2 各組大鼠肝纖維化分期（%）比較

2.2 各組大鼠肝組織形態學變化 在光學顯微鏡下觀察可見，正常組大鼠肝組織無明顯異常,其結構完整,細胞膜清晰，核仁明顯且細胞質豐富，無膠原纖維增生沉積；模型組大鼠肝組織出現大面積脂肪變性，多數細胞核消失，纖維增生明顯；與模型組比，蝦青素Ⅰ組和蝦青素Ⅱ組大鼠肝組織損傷表現呈好轉趨勢，大劑量蝦青素處理組表現更明顯（圖1）。Masson染色觀察，有少量細小的藍色膠原纖維出現在正常大鼠肝組織匯管區周圍，未見纖維增生，而在模型組大鼠，見肝組織大量膠原纖維增生，形成粗大的纖維間隔，將肝小葉分隔成大小不等的假小葉；給予蝦青素和秋水仙堿干預后，肝組織膠原纖維增生明顯減少（圖2）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現（HE，200×）

圖2 各組大鼠肝組織病理學表現（Masson，200×）

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達（±s）比較

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 CollagenⅠ TGF-β1 Smad2 p-ERK正常組 10 0.4±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.4±0.1模型組 10 1.7±0.4① 1.7±0.4① 1.6±0.3① 1.6±0.5①蝦青素Ⅰ組 10 1.4±0.3①② 1.4±0.4①② 1.3±0.4①② 1.2±0.4①②蝦青素Ⅱ組 10 1.2±0.3①② 1.2±0.3①② 0.8±0.4①② 0.9±0.3①②秋水仙堿組 10 0.4±0.1② 0.6±0.1② 0.5±0.1② 0.5±0.1②

2.3 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK蛋白表達的變化 與正常組比較，模型組肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比，蝦青素Ⅰ組、蝦青素Ⅱ組和秋水仙堿組大鼠肝組織四種蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05，表 3、圖 3～6）。

2.4 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK mRNA水平變化 與正常組比，模型組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK mRNA水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比，蝦青素Ⅰ組、蝦青素Ⅱ組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和 p-ERK mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著劑量的增加，下降更明顯（P＜0.05，表 4、圖 7）。

圖3 各組大鼠肝組織CollagenⅠ蛋白表達的變化（免疫組化，200×）

圖4 各組大鼠肝組織Smad2蛋白表達的變化（免疫組化，200×）

圖5 各組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達的變化（免疫組化，200×）

圖6 各組大鼠肝組織p-ERK蛋白表達的變化（免疫組化，200×）

表4 四組大鼠肝組織蛋白基因（m RNA）水平（±s）比較

表4 四組大鼠肝組織蛋白基因（m RNA）水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 CollagenⅠ TGF-β1 Smad2 p-ERK正常組 10 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.1±0.1模型組 10 2.4±0.4① 2.5±0.5① 2.5±0.6① 2.6±0.5①蝦青素Ⅰ組 10 2.0±0.4①② 2.1±0.4①② 2.0±0.5①② 2.1±0.4①②蝦青素Ⅱ組 10 1.8±0.5①② 1.6±0.3①② 1.8±0.4①② 1.8±0.3①②秋水仙堿組 10 1.1±0.1② 1.2±0.1② 1.1±0.1② 1.1±0.1②

圖7 各組大鼠肝組織蛋白基因（mRNA）水平變化

3 討論

本研究通過注射四氯化碳制備肝纖維化大鼠模型，觀察了蝦青素干預對大鼠肝纖維化的影響，實驗發現，不同劑量的蝦青素干預大鼠6周后，肝組織膠原纖維增生程度降低，大鼠肝纖維化程度明顯減輕，提示蝦青素對肝纖維化進程具有抑制作用。

已有研究指出，肝纖維化形成的中心環節是肝星狀細胞的活化[9-11]。ERK通路與肝星狀細胞的功能關系密切，參與了肝纖維化進程的調節。在四氯化碳所致的肝纖維化大鼠，肝組織ERK基因表達明顯增強[12，13]。應用MEK抑制劑處理大鼠后，ERK活性降低，且肝星狀細胞的增殖也受到明顯的抑制[14]。本實驗發現，蝦青素處理組大鼠肝組織p-ERK蛋白及其mRNA水平均呈下降趨勢，并隨著蝦青素劑量的加大變得明顯，提示蝦青素對肝纖維化大鼠的保護作用可能與抑制ERK通路有關。

在肝星狀細胞活化后，合成細胞外基質增多，Ⅰ型膠原等細胞外基質成分沉積增多[15，16]。TGF-β1/Smad信號通路在肝星狀細胞活化過程具有重要作用。TGF-β1具有誘導細胞分化、促進肝星狀細胞活化及細胞外基質合成分泌作用，Smad蛋白為TGF-β的受體后蛋白，在肝纖維化信號通路中起到信號轉導作用[17，18]。TGF-β1/Smad 信號通路在致病因子的刺激下，表達增多，引起肝纖維化的形成。動物實驗表明，Smad基因片段的缺失可對肝纖維化起到抑制作用[19]。本研究結果顯示，蝦青素能夠顯著下調Smad、Ⅰ型膠原和TGF-β1表達，減輕肝損傷，延緩肝纖維化進程。