HCV感染相關(guān)干擾素L4真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

徐 溪，黨引利，吳 朔

我國人群HCV感染率約為0.43%，有約1300萬感染者。研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染與患者自身的基因多態(tài)性（genetic polymorphisms）有關(guān)，而患者基因組特殊單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）的狀況是影響預(yù)后的重要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素28B（IL-28B）基因多態(tài)性與慢性丙型肝炎（chronic Hepatitis C，CHC）患者持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率（sustained virological response，SVR）密切相關(guān)，宿主IL-28B基因rs12979860位點為CC純合子表型的個體較CT和TT表型的個體有更高的自發(fā) HCV 清除率[1，2]。2014 年，Prokunina-Olsson研究組在IL-28B基因區(qū)附近發(fā)現(xiàn)了一個新的SNP位點，此位點的SNP多態(tài)性可產(chǎn)生一個被稱為干擾素 λ4（interferon-lambda 4，IFN-λ4或 IFNL4）的新基因[3，4]。這個SNP位點位于IFNL3和IFNL2之間，即ss469415590，具有ΔG/TT雙核苷酸序列多態(tài)性。如果該位點為ΔG，則該區(qū)域可因此產(chǎn)生一個新的開放閱讀框，而這個位點如果是TT，則這個開放閱讀框?qū)⒈惶崆敖K止。這個被創(chuàng)造或者提前終止的基因就是IFNL4。既往研究沒有早期發(fā)現(xiàn)IFNL4的主要原因是通常它在細(xì)胞中的表達(dá)豐度較低，僅在特定類型細(xì)胞受到特殊刺激條件下才會轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，正常肝細(xì)胞并不表達(dá)IFNL4，而當(dāng)其受到HCV感染刺激后才產(chǎn)生一定水平的IFNL4。

本課題組從含人IFNL4基因序列的質(zhì)粒pFC14A-p179中克隆了IFNL4基因片段，并構(gòu)建了攜帶His標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究IFNL4的功能并解釋其與HCV感染的關(guān)系提供了依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒與試劑 293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；E.Coli DH5a由本實驗室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His購自Invitrogen公司；含人IFNL4基因序列質(zhì)粒pFC14A-p179由美國癌癥研究 所 （National Cancer Institute，NCI） 的 Ludmila Prokunina-Olsson博士饋贈。DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青工程材料有限公司；PrimerSTAR Max DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、DNA電泳凝膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒均購于大連TaKaRa公司；LipofectamineTM 2000購自Invitrogen公司；DNA中提試劑盒購自QIAGEN公司；抗鼠His-Tag單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物公司。

1.2 pcDNA3.1-IFNL4-His重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)IFNL4基因序列，利用Oligo6.0軟件分析設(shè)計了一對引物，其序列如下：上游引物為F1：5'-TAGCCGTCTAGAATGCGGCCGAGTGTCTGG GCC-3'（XhoI），下游引物為 R1：5'-AGCCTCGAG GAGGCAAGGCCCAGAGTGTGCAG-3'（XbaI），由上海桑尼生物科技有限公司合成。以質(zhì)粒pFC14A-p179為模板，PCR條件為：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 5 s，共35個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)

1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。分別用XhoI和XbaI雙酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體，用DNA電泳凝膠回收試劑盒回收目的酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶在14℃連接16 h后轉(zhuǎn)化。挑選Amp抗性克隆，搖菌后通過對菌液PCR初步鑒定出陽性克隆，小提質(zhì)粒后用XhoI和XbaI雙酶切驗證出陽性克隆，送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。將構(gòu)建好的載體擴(kuò)大培養(yǎng)后，用DNA中提試劑盒提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計測定其濃度。取對數(shù)生長期的293-T細(xì)胞，消化處理后接種于6孔板，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞生長至90%融合時轉(zhuǎn)染。首先，將載體與轉(zhuǎn)染試劑按照1:3混合，在Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育20 min，同時將細(xì)胞用不含雙抗和血清的DMEM培養(yǎng)基清洗3次，之后將DNALipofectamineTM2000復(fù)合物逐滴加入各孔。37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)4 h，棄去復(fù)合物，PBS清洗細(xì)胞2次，換含10%FBS DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，離心，收集細(xì)胞，設(shè)轉(zhuǎn)染組和空白細(xì)胞組。加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白上樣，用抗鼠His-Tag單克隆抗體進(jìn)行Western-blot檢測，鑒定IFNL4-His融合蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 IFNL4目的基因的擴(kuò)增 以pFC14A-p179質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，模板量分別為100 ng和50 ng，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在540 bp左右的位置處均可見一明亮的條帶，其大小與目的基因相符（圖1）。

圖1 IFNL4基因的PCR全長擴(kuò)張

2.2 重組真核表達(dá)載體的酶切鑒定 因IFNL4基因片段約為540 bp，載體骨架約為5500 bp。分別用XhoI和XbaI雙酶切陽性克隆后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)片段大小均與預(yù)期一致。測序結(jié)果顯示目的基因序列正確，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體（圖 2）。

2.3 IFNL4-His融合蛋白表達(dá)鑒定 將細(xì)胞裂解后提取蛋白，經(jīng)Western blot檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示IFNL4-His融合蛋白在20 kD處出現(xiàn)單一目標(biāo)條帶，與推測的分子量大小相符，內(nèi)參GAPDH在36 kD處出現(xiàn)單一目標(biāo)條帶（圖 3）。

圖2 構(gòu)建重組真核表達(dá)載體插入片段的酶切鑒定

圖3 IFNL4-His融合蛋白表達(dá)情況的western blot檢測

3 討論

在人類基因組中，一共有三個干擾素相關(guān)的基因區(qū)域，即 IFNL1、IFNL2和 IFNL3（IL29、IL28A、IL28B），它們的表達(dá)可通過JAK-STAT信號通路和干擾素刺激基因ISGs的調(diào)控抑制病毒的復(fù)制[3，5]。研究通過polyI:C刺激細(xì)胞后對細(xì)胞mRNA文庫測序發(fā)現(xiàn)，除IFNL1、IFNL2和IFNL3外，在某些人群中還存在一個約150 kb的表達(dá)序列。應(yīng)用5’RACE技術(shù)克隆出全長基因后發(fā)現(xiàn)，這個區(qū)域存在著一個SNP位點，即ss469415590（TT＞ΔG）。這一位點定位在IFNL3上游3 kb的地方[6-9]。轉(zhuǎn)錄譜分析結(jié)果顯示，這一區(qū)域存在10個不同長度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中最有意義的是p179蛋白，其與IFNL3有約40.8%的相似性，這個蛋白即之后被稱為IFN-λ4或IFNL4的新基因[6]。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，雖然IFNL4沒有三型干擾素與IL10R2相互作用的D螺旋結(jié)構(gòu)域，但其與IFNL3相似，都存在A和F螺旋結(jié)構(gòu)域，而這是三型干擾素的核心部分[10-14]。

IFNL4的ss469415590位點多態(tài)性與IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎患者療效間存在負(fù)相關(guān)性[15-18]，這種現(xiàn)象提示IFNL4在機(jī)體抗病毒免疫過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究證實，IFNL4可通過誘導(dǎo)細(xì)胞STAT1和STAT2信號分子的磷酸化，激活下游的信號通路，對細(xì)胞骨架具有重要影響。研究認(rèn)為，這種結(jié)構(gòu)變化可能影響到細(xì)胞對HCV的敏感性及炎癥應(yīng)答方式。IFNL4可被PolyI:C刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，并進(jìn)而激活多種干擾素誘導(dǎo)基因（ISGs）的表達(dá)[5，6]，例如，干擾素刺激應(yīng)答元件（interferon-stimulated response element，ISRE） 可 應(yīng) 答IFNL4 刺激，調(diào)控包括 STAT1、ISG15、IFIHI1-MDA5、OAS1、MX1和DHX58-RIG-I等ISGs的表達(dá)，從而影響細(xì)胞代謝及抗病毒應(yīng)答的不同方式[5，7]。

在IFNL4發(fā)現(xiàn)之前，一直很難解釋為什么IL28B基因多態(tài)性位點rs12979860與HCV清除相關(guān)，因為這個位點并不引起編碼蛋白質(zhì)的改變[8]。盡管rs12979860可能通過影響基因調(diào)控，從而產(chǎn)生干擾素表達(dá)差異，但I(xiàn)FNL4的發(fā)現(xiàn)為這種免疫應(yīng)答差異提供了一種更直接的解釋。由于IFNL4位點ss469415590和IL28B的rs12979860緊密連鎖，因此rs12979860不同基因型產(chǎn)生的免疫應(yīng)答變化很可能在一定程度上只是ss469415590多態(tài)性變化的反映，細(xì)胞是否產(chǎn)生IFNL4可能是影響治療丙型肝炎效果的直接原因。例如，不同ss469415590基因型（ΔG/TT）可決定細(xì)胞是否能夠產(chǎn)生IFNL4，進(jìn)而通過改變ISG表達(dá)變化，形成免疫應(yīng)答的差異[6]。

值得注意的是，ss469415590位點的ΔG/TT在亞洲人中等位基因不平衡，在多數(shù)個體中該位點為TT型，尤其是在中國人中，幾乎全部的個體均攜帶TT型的ss469415590。因此，多數(shù)亞洲人機(jī)體不能產(chǎn)生有功能的IFNL4蛋白。而在歐洲和非洲裔人種，TT和ΔG均在基因組中存在，TT為優(yōu)勢基因型，兩種變體之間的ΔG約占總基因數(shù)的三分之一。因此，IFNL4可用來預(yù)測歐洲和非洲裔人種HCV感染的治療效果。而對于亞洲人種而言，這種預(yù)測卻是不可行的。但有趣的是，亞洲人接受pegIFN-α/RBV治療后的療效較歐洲和非洲裔人種更好，約90%亞裔患者在接受pegIFN-α/RBV治療均可獲得SVR，遠(yuǎn)高于歐洲和非洲裔人種的40%，這種現(xiàn)象在一定程度上也印證了IFNL4表達(dá)與治療丙型肝炎療效呈負(fù)相關(guān)的結(jié)論[5]。

IFNL4作為一種獨(dú)特的干擾素分子，可能通過其對細(xì)胞的特異性信號激活通路對機(jī)體和免疫應(yīng)答產(chǎn)生重要的影響，對其表達(dá)、純化及功能研究可能對免疫治療和新藥開發(fā)具有重要意義[14]。另外，雖然該基因?qū)Ω螌嵸|(zhì)細(xì)胞的影響已得到了充分研究[19，20]，但其對免疫細(xì)胞功能的影響依然不清楚。本課題通過對人IFNL4基因的擴(kuò)增、載體構(gòu)建和真核表達(dá)，初步建立了IFNL4的表達(dá)體系，為后續(xù)研究IFNL4的功能和潛在的藥用價值提供了實驗基礎(chǔ)。