MiR-384對(duì)HFFA誘導(dǎo)的Hepa1-6細(xì)胞sirt3/FOXO1信號(hào)通路的影響*

麥靜愔，陳天陽(yáng)，平 鍵，成 揚(yáng)，陳建杰

本研究以高度游離的脂肪酸（HFFA）誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞，建立非酒精性脂肪性肝炎體外細(xì)胞模型，觀察了MiR-384對(duì)細(xì)胞sirt3/FOXO1信號(hào)通路的影響，以探討非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 發(fā)病機(jī)制與MiR-384之間的關(guān)系，為NAFLD的防治提供潛在的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；油酸酯（OA）、棕櫚酸酯（PA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-384模擬物、抑制劑和陰性對(duì)照及si-sirt3均購(gòu)自廣州RiboBio公司；兔抗sirt3多克隆和抗FOXO1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；檢測(cè)SOD和CAT試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞模型制備及干預(yù) 取Hepa1-6細(xì)胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，換含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入OA和PA儲(chǔ)存液，使兩者終濃度分別為1 mmol/L和0.5 mmol/L，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24 h，建立非酒精性脂肪性肝炎體外細(xì)胞模型。測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，評(píng)估模型建立成功與否。隨后，分別用miR-384 模 擬 物 、miR-ctrl、miR-384 抑 制 劑 、miR-384抑制劑 -ctrl、沉默信息調(diào)節(jié)因子 3（si-sirt3）或si-ctr l轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測(cè) 以濃度為80 μmol/L 2，7-二氯熒光素二乙酸酯的熒光染料與Hepa1-6細(xì)胞37℃孵育30 min，隨后上流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，細(xì)胞經(jīng)造模和分組干預(yù)后，吸棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS漂洗，以RIPA裂解緩沖液抽提細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取細(xì)胞蛋白30 μg，經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜在5%脫脂奶粉中封閉，并與抗sirt3或抗FOXO1（1：1000）孵育過(guò)夜。次日，在TTBS洗滌三次后，加入相應(yīng)二抗（1：5000）1 h，室溫孵育，加 ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影。應(yīng)用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶，應(yīng)用GAPDH或者β-actin(校正目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞抗氧化酶活性檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和抗氧化蛋白過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。

2 結(jié)果

2.1 各組Hepa1-6細(xì)胞ROS水平比較 與正常組（0.66±0.01）比，miR-384模擬物組和si-sirt3組細(xì)胞內(nèi) ROS水平顯著升高 [分別為（37.3±1.13）和（10.4±0.36），P＜0.01]；與 HFFA 組（29.4±0.98）比，HFFA/miR-384抑制劑組細(xì)胞內(nèi) ROS水平顯著降低[（12.8±0.41），P＜0.01，圖 1]。

圖1 各組Hepa1-6細(xì)胞ROS水平變化

2.2 各組Hepa1-6細(xì)胞sirt3蛋白表達(dá)情況 4組Hepa1-6細(xì)胞sirt3蛋白表達(dá)量不同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 2）；與正常（0.75±0.04）Hepa1-6細(xì)胞sirt3蛋白表達(dá)水平比，HFFA組細(xì)胞顯著降低[（0.23±0.01），P＜0.01]；與 HFFA 組比，HFFA/sirt3組顯著增加 [（0.83±0.03），P＜0.01]；與 HFFA/sirt3組比，HFFA/sirt3/miR-384組顯著降低 [（0.46±0.02），P＜0.01]，提示 miR-384 可以抑制細(xì)胞 sirt3的表達(dá)。

圖2 各組Hepa1-6細(xì)胞Sirt3蛋白表達(dá)比較

2.3 各組Hepa1-6細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 與對(duì)照組比，miR-384模擬物組Hepa1-6細(xì)胞sirt3蛋白和Forkhead轉(zhuǎn)錄因子O亞家族（FOXO）成員FOXO1 蛋白的表達(dá)顯著減少[（0.3±0.01）對(duì)（0.2±0.01），P＜0.01]， 而 CAT 和錳 超 氧 化 物 歧 化 酶（MnSOD）表達(dá)顯著增加 [（2.3±0.05）對(duì)（2.4±0.06），P＜0.01]；與 HFFA 組比，HFFA/miR-384 抑制劑組Hepa1-6細(xì)胞sirt3蛋白和FOXO1蛋白的表達(dá)顯著增加[（0.5±0.02）對(duì)（0.7±0.01），P＜0.01]，MnSOD和CAT表達(dá)水平顯著降低 [（2.0±0.03）對(duì)1.6±0.04），P＜0.01，圖 3]。

圖3 各組Hepa1-6細(xì)胞sirt3、FOXO1、MnSOD和CAT蛋白表達(dá)變化

2.4 脂肪變Hepa1-6細(xì)胞抗氧化酶SOD和CAT的活性檢測(cè)情況 與NAFLD組SOD（327±3.45）和CAT（386±4.03）活性相比，正常組 SOD 和CAT[分別為（425±5.49）和（512±6.04），P＜0.01]和 miR-384 抑制劑組 SOD 和 CAT[分別為（406±4.79）和（447±5.38），P＜0.01]的活性顯著升高（圖 4）。

圖4 miR-384抑制劑對(duì)脂肪變Hepa1-6細(xì)胞SOD和CAT活性的影響

3 討論

Sirt3是sirtuins家族即NAD+依賴(lài)的第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；傅某蓡T之一[1-5]，主要分布于線粒體中，能調(diào)節(jié)線粒體功能的許多方面，包括代謝、ATP生成、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)等，處于線粒體功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵地位，是代謝功能和細(xì)胞生存的中樞調(diào)節(jié)因子，并且對(duì)抗衰老和癌癥發(fā)生的作用較明顯，可能與細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)[6-9]。相關(guān)研究表明Sirt3參與NAFLD的發(fā)病，上調(diào)Sirt3的表達(dá)可明顯減輕NASH損傷，同時(shí)Sirt3過(guò)表達(dá)能夠降低FOXO1乙?；瑫r(shí)提高CAT和MnSOD表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[10-13]。

本研究為了評(píng)估m(xù)ir-384與sirt3靶向功能的相關(guān)性，將小鼠sirt3編碼序列插入到pTarget載體中，并用該pTarget-sirt3載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，重新獲得sirt表達(dá)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)評(píng)估用miR-384模擬物或陰性對(duì)照以及pTarget-sirt3或空載體共轉(zhuǎn)染的Hepa1-6細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，結(jié)果在miR-384模擬物存在下，sirt3的強(qiáng)制表達(dá)拯救了ROS水平。因此，sirt3是調(diào)節(jié)Hepa1-6細(xì)胞中氧化應(yīng)激的miR-384下游的功能相關(guān)目標(biāo)[14-16]。

為了進(jìn)一步研究miR-384在HFFA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪毒性中的作用，我們分析了miR-384模擬或抑制劑轉(zhuǎn)染后SOD和CAT的活性。與對(duì)照組比，用miR-384模擬單獨(dú)或與HFFA轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞都能誘導(dǎo)SOD和CAT活性的顯著降低。相反，miR-384抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了HFFA誘導(dǎo)的脂毒性的促進(jìn)作用。然而，通過(guò)siRNA抑制sirt3增強(qiáng)Hepa1-6細(xì)胞氧化損傷，并阻止miR-384抑制劑對(duì)HFFA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的抑制作用，表明miR-384在HFFA處理的細(xì)胞中靶標(biāo)是sirt3。因此，在具有或不具有miR-384過(guò)表達(dá)的Hepa1-6細(xì)胞中檢測(cè)了sirt3/FOXO1途徑的關(guān)鍵組分的表達(dá)。由HFFA誘導(dǎo)的MiR-384上調(diào)和用miR-384模擬物處理也在Hepa1-6細(xì)胞中下調(diào)了FOXO1和Nuc FOXO1的表達(dá)，而用miR-384抑制劑處理可顯著增加FOXO1和Nuc FOXO1水平。此外，由于MnSOD和CAT是sirt3/FOXO1途徑的下游靶標(biāo)，所以miR-384過(guò)表達(dá)可抑制sirt3/FOXO1途徑，繼而降低MnSOD和CAT水平。因此，miR-384過(guò)表達(dá)能加速細(xì)胞氧化損傷[17-19]。

綜上所述，目前的研究結(jié)果表明miR-384的靶標(biāo)是sirt3，從而導(dǎo)致HFFA誘導(dǎo)的氧化損傷加重，部分是通過(guò)抑制sirt3/FOXO1途徑實(shí)現(xiàn)的。因此，miR-384可以作為NAFLD的潛在生物標(biāo)志物和有效的治療靶標(biāo)，為以后的新藥研發(fā)提供新的理論依據(jù)。