拋物線布點法在灘涂貝類養殖區微生物監測中的應用

陳 瑜，張小軍，嚴忠雍，何依娜，許 丹

(浙江省海洋水產研究所 浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江 舟山 316021)

微生物是港灣生態系統的重要組成部分, 在物質循環和能量流動中發揮著重要的作用，其數量及生物多樣性可以作為海洋環境監測的生物學指標。港灣生態系統相對獨立，在水動力等自然條件作用下，受海洋開發活動及外來污染影響尤為突出，由于人類對港灣資源的過度開發利用，沿灣地區環境污染日趨嚴重，直接引起病原微生物的大量滋生，破壞港灣生態系統平衡。貝類是一種非選擇濾食性生物，在生長過程中易積累和富集環境中的病原微生物[1]。富集的微生物通過食物鏈轉移到人體內，會嚴重危害身體健康[2]。因此，開展灘涂貝類及生長環境的微生物監測以及貝類養殖環境評價[3]，對灘涂貝類養殖業的健康持續發展及貝類食品安全具有重要的意義[4]。

農業部漁業局從2003年起，對我國主要貝類養殖海區的環境狀況以及養殖貝類衛生狀況進行了分類管理工作[5]。同時，經過多年的貝類劃型工作和長期的總結經驗發現：貝類監測點的布設決定著監測數據能否有效地反映研究區域的環境質量狀況，是貝類監測和劃型的重要一環，但對于不同類型的養殖生產海域還沒有明確的監測站位布設原則和方法。因此，本研究根據樂清灣北部貝類養殖生產區所屬海域，提出了港灣灘涂貝類養殖生產海域監測站位布設原則和方法，并對建立的監測站位布設原則和方法進行驗證和結果評價，為完善貝類劃型工作方案提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

隔水式恒溫培養箱(型號GHP-9270)；智能光照培養箱(型號(GXZ)；生物安全柜(型號 BSC-1000ⅡA2)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(型號YXQ-LS-50G)；其他實驗室常用設備。

1.2 培養基及試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、EC肉湯(E.coli broth)、伊紅美藍(EMB)瓊脂、營養瓊脂、平板計數瓊脂(PCA)、2216E瓊脂、乳糖蛋白胨培養基、HBI生化鑒定試劑盒，均購自青島海博生物技術有限公司。所有培養基均需121 ℃高壓滅菌20min；其余為實驗室常用試劑。

1.3 貝類監測點確定及試驗方法

1.3.1 監測點的確定

本研究以樂清灣北部為貝類研究海域，即樂清灣以北開展貝類產品采樣布點。并以北緯28.278 N為橫軸，東經121.186 E為縱軸，港灣頂端為拋物線頂點，沿港灣海岸線畫拋物線。其中X軸標尺約850 m，Y軸標尺約710 m。以坐標軸0為中心，每一個X軸標尺為橫坐標在拋物線上布點，如圖1。此時，有15個監測點被初步確定，但由于不是所有的點都是貝類養殖點，通過對灘涂貝類實際養殖情況的調查研究，13個監測點被最終確認。如圖2。監測點具體坐標及地理位置如表1所示。

對于以上選取的13個監測點，分別于8月、9月和10月進行3個批次的縊蟶樣品抽樣檢測，每個樣品做三個重復。

采集的縊蟶分別放置在無菌的拉鏈袋中，然后在4 °C保存，在采集后24 h內進行處理，在實驗室中用干凈的自來水沖洗，用75%消毒棉球擦洗，用無菌鉗打開。

1.3.2 貝類大腸桿菌和菌落總數的檢測

大腸桿菌按照GB4789.38-2012食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數。將貝類撬殼稱取25 g 肉，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液中均質，制作成1∶10的樣品勻液。選擇3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管，然后放入培養箱中培養。經過初發酵、復發酵和生理生化試驗，計數陽性管數，查MPN 表。

菌落總數按照GB4789.2-2010食品微生物學檢驗菌落總數測定。將貝類撬殼稱25 g肉，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液中均質，制作成1∶10 的樣品勻液。然后，選擇合適的3 個稀釋度，每個稀釋度做2個平板，用滅菌冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，( 30±1) ℃培養( 72±3) h。選擇菌落數在30～300 CFU之間連續兩個稀釋度的平板，按公式計算樣品中均落數。

圖1 初定貝類監測點

監測點經緯度地理位置1E 121°06.922 N 28°16.697樂清市清江鎮2E 121°08.233 N 28°18.126樂清市清江鎮3E 121°08.712 N 28°19.590樂清市雁蕩鎮4E 121°10.053 N 28°20.671樂清市雁蕩鎮5E 121°10.755 N 28°22.313樂清市大荊鎮6E 121°11.301 N 28°22.915樂清市湖霧鎮

表1(續)

1.4 海水監測點確定及試驗方法

1.4.1 海水監測點確定

布點方法參照貝類產品拋物線，以北緯28.278 N為橫軸，東經121.186 E為縱軸，港灣頂端為拋物線頂點，沿港灣海岸線畫拋物線。以坐標軸0為中心，每隔三個X軸標尺為橫坐標在拋物線上布點，得到7個海水監測點(1，3，4，6，7，8和10)，同時，在坐標軸Y軸上取3個監測點(2，5和9)做對照，最終10個海水監測點被確定，如圖3。

分別于8月、9月和10月對以上選取的10個海水監測點進行3個批次的海水樣品抽樣檢測，每個樣品做三個重復。

圖3 海水站位監測點

監測點經緯度1E 121°07.512 N 28°16.6802E 121°11.160 N 28°16.6803E 121°14.327 N 28°16.6804E 121°08.905 N 28°19.4765E 121°11.160 N 28°19.4766E 121°13.293 N 28°19.4767E 121°10.164 N 28°20.7258E 121°13.174 N 28°20.7259E 121°11.160 N 28°21.67010E 121°11.160 N 28°22.796

1.4.2 海水糞大腸菌群和細菌總數的測定

海水中糞大腸菌群和細菌總數的檢測按照GB17378.7-2007海洋監測規范第7部分近海污染生態調查和生物監測。

糞大腸菌群的檢測。將3個適宜梯度的的海水樣品接種到44 ℃乳糖蛋白胨肉湯中，每個梯度接種5管，置于恒溫培養培養24 h，將有產酸和產氣跡象的乳糖蛋白胨管傳代到EC肉湯中進行復發酵試驗，在恒溫培養箱44±0.5 ℃下培養24 h。在此期間產酸且產氣的即為陽性管，通過查表得糞便大腸菌群MPN值。

菌落總數的檢測。以無菌操作吸取1ml水樣注入盛有9mL滅菌陳海水的試管內混合，并依同法依次連續稀釋至所需要的稀釋度(倍數)。稀釋度依水樣含菌量而定，選擇合適的3 個稀釋度，每個稀釋度做2個平板，用滅菌冷卻至25 ℃的2216E瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，25℃培養7d。選擇菌落數在30～300 CFU之間連續兩個稀釋度的平板，按公式計算樣品中均落數。

1.5 數據分析

所有數據都經過lg X轉化，統計分析實驗數據，最后通過EXCEL做圖。

2 實驗結果與分析

2.1 貝類樣品微生物監測結果分析

從大腸桿菌分布圖(圖4)可以看出，縊蟶樣品中大腸桿菌的數量沿樂清灣北部沿岸呈類似拋物線分布。大腸桿菌的數值在樂清灣頂部縊蟶樣品中表現最高，并且沿貝類河床往下呈減少趨勢。其中，監測點5，6，7和8抽取的縊蟶樣品中大腸桿菌的數值顯著性高于其它監測點，而且在三次監測中均超出二類貝類生產區4600 MPN/100 g的限值。另外，監測點1(包含三個批次)和監測點10(包含兩個批次)的縊蟶樣品中大腸桿菌的數值也都超過了4600 MPN/100 g的限值。其它監測點的縊蟶樣品大腸桿菌數值均未超過4600 MPN/100 g的限值。

從菌落總數分布圖(圖5)可以看出，與大腸桿菌分布相似，縊蟶樣品中菌落總數的數量也呈類似拋物線分布。處于拋物線頂端的監測點5，6，7和8抽取的縊蟶樣品中菌落總數的數值顯著性高于其它監測點，此外，監測點1和監測點10的縊蟶樣品中菌落總數的數值也相對偏高。因此，縊蟶中大腸桿菌與菌落總數的數值呈一定的正相關。

圖4 不同站位大腸桿菌數量(8～10月)

Fig.4 The numbers of E.coli within S.constricta flesh fromdifferent sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

圖5 不同站位菌落總數數量(8～10月)

Fig.5 The numbers of ACC within S.constricta flesh from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

2.2 海水樣品微生物監測結果分析

從糞大腸菌群分布圖(圖6)可以看出，位于樂清灣頂部(即拋物線頂點附近)監測點7～10采集的海水樣品中，糞大腸菌群的數量顯著性高于其它監測點。相反地，監測點2～6海水中糞大腸菌群的數值較低。然而，監測點1的海水卻表現出較高含量的糞大腸菌群。結合貝類監測點采集的數據，我們發現縊蟶中大腸桿菌與海水中糞大腸菌群的含量呈一定的正相關。另外，通過對比同一緯度線上三個點(1, 2, 3 和 4, 5, 6)，糞大腸菌群數值呈現中間低兩邊高的趨勢，即位于中間監測點采集的海水比沿岸監測點采集的海水糞大腸菌群數值相對較低。一些研究已經證明，地表徑流、污水排放和港口開發等都會直接導致近岸海域海水糞大腸菌群含量的增加。因此離沿岸和人類生活區距離越近其海水中糞大腸菌群數值就越高，這與本研究的結果一致。此外，監測點1位于清江入海口，監測點8位于江廈排撈隧洞入海口，這兩個監測點更容易受污染而表現出高含量的糞大腸菌群。

分析細菌總數分布圖(圖7)，沒有發現顯著性的規律，而且海水中細菌總數和糞大腸菌群的含量并沒有顯示相關性。

圖6 不同站點海水糞大腸菌群數量(8～10月)

Fig.6 The numbers of faecal coliform within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

圖7 不同站點細菌總數含量(8～10月)

Fig.7 The numbers of TBC within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

3 樂清灣貝類產區劃分分析

港灣的海水交換能力是海水微生物含量一個重要的影響因素，海水的交換速率直接決定了海水的自凈能力[6]。在本研究中，貝類監測點5，6，7 和 8位于樂清灣的頂端，其海水交換速率相對較慢，因此，該區域海水和貝類中糞便指示菌的含量要顯著性高于其它監測點。監測數據也顯示了該區域采集的縊蟶樣品其大腸桿菌含量顯著性偏高，而且超過了二類生產區4600 MPN/100g的限值。依據(農漁發[2016]8號)文件和三次貝類監測數據，我們建議以監測點8為界，即28.367 N以北的樂清灣北部海區劃為三類貝類生產區[7]，如圖8。一些研究表明當長期暴露于受污染的海水環境中時，貝類會富集高濃度的糞便病原菌[8-9]。在本研究中，貝類監測點1和10位于江河入海口，因此該區域貝類生長海水極易受生活污水、養殖尾水、工業廢水和生產活動等的影響。監測數據也顯示了在采集的縊蟶樣品中，來自監測點1的三個批次和監測點10的兩個批次的縊蟶樣品其大腸桿菌數值過了二類生產區4600 MPN/100g的限值。然而，對于該區域附近的其它監測點，采集的三批次縊蟶樣品均未超過4600 MPN/100g。因此，綜合考慮，將28.367 N以南，28.278 N以北的樂清灣北部海域劃為二類貝類生產區，同時要重點加強對貝類監測點1和10的監測，如圖8。

圖8 樂清灣貝類產區劃分示意

4 結論

本研究將拋物線定點法初步運用于港灣灘涂貝類養殖生產海域的貝類及生長海水站位布設。研究表明，縊蟶樣品大腸桿菌和菌落總數的數量沿樂清灣北部沿岸均呈類似拋物線的分布，其數值在樂清灣頂部采集的縊蟶樣品中顯示最高，并且沿貝類河床往下呈減少趨勢。且大腸桿菌與菌落總數的數值呈一定的正相關。同時，我們發現縊蟶大腸桿菌與海水糞大腸菌群的含量也呈一定的正相關。另外，通過對比同一緯度線上三個點，糞大腸菌群數值呈現中間低兩邊高的趨勢，即位于中間監測點采集的海水比沿岸監測點采集的海水糞大腸菌群數值相對較低。分析細菌總數含量分布圖，沒有發現顯著性地規律。最后，依據(農漁發[2016]8號)文件和三次貝類監測數據，綜合考慮將8.367 N以北的樂清灣北部海區劃為三類貝類生產區，將28.367 N以南，28.278 N以北的樂清灣北部海域劃為二類貝類生產區，同時要重點加強對貝類監測點1和10的監測。