乳腺癌組織中叉頭蛋白F1表達與乳腺癌臨床生物學參數及預后的關系

王慶偉，徐振雷

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院：1.檢驗科；2.燒傷整形科，江蘇淮安 223001)

乳腺癌在女性中是發病率很高的腫瘤，并且其發病率逐年上升，得益于治療手段的綜合運用和治療水平的提高，近年來乳腺癌患者的預后得到較大的改善，但仍不容樂觀，因此尋求乳腺癌新的治療手段迫在眉睫，近年來生物學標志物和功能基因一直是乳腺腫瘤研究領域的熱點[1]。轉錄因子叉頭蛋白F1(FOXF1)是肺發育和肺損傷/修復的關鍵調節因子，已有研究在有肺靜脈錯位的肺泡毛細血管發育不良患者中發現FOXF1基因位點雜合缺失或點突變，此疾病是罕見的先天性疾病，其特點是肺泡毛細血管網嚴重發育缺陷[2-3]。FOXF1的異常表達與結腸癌、肺癌、前列腺癌的進展密切相關[4-6]。目前，FOXF1在乳腺癌中的研究很少[7]，本研究擬觀察乳腺癌組織中FOXF1的表達水平，并且研究乳腺癌組織中FOXF1的表達與臨床病理參數及患者預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1標本來源 139對乳腺癌組織及對應癌旁組織的芯片為上海芯超生物科技有限公司產品，包括完整的臨床病理資料，如年齡、性別、淋巴結轉移、腫瘤大小、TNM分期、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、原癌基因人類表皮生長因子受體-2(HER-2)染色和隨訪資料等信息。

1.2儀器與試劑 免疫組織化學試劑盒購自上海吉泰生物科技有限公司，鼠抗人FOXF1抗體購自美國西格瑪(sigma)公司，兔抗鼠二抗及鼠抗人鈣黏附蛋白E(E-cadherin)、鈣黏附蛋白N(N-cadherin)檢測試劑盒購自美國CST公司。

1.3方法 免疫組織化學檢測：芯片經10%的甲醛固定后使用乙醇脫水，石蠟包埋后采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法染色，根據試劑盒說明書嚴格控制染色過程，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，每次試驗用已知陽性片作為陽性對照。

免疫組織化學結果判定：將組織切片放置在光學顯微鏡下進行觀察和評分，并且進行病理圖像采集。FOXF1主要定位在細胞核中，綜合高倍鏡下染色強度和陽性細胞百分率進行陰陽性判斷[8]。染色強度方面，基本未著色評分為0分，著色為淡黃色評分為1分，著色為棕黃色評分為2分，著色為黃褐色評分為3分。陽性細胞百分率評分標準為芯片置于顯微鏡下計數500個細胞，陽性細胞百分率<10%評為0分；10%～<40%評為1分；40%～<70%評為2分，≥70%評為3分。將染色強度和陽性細胞百分率評分相加后得到的總分作為陰陽性判斷的依據，0～2分評定為陰性；>2～6分評定為陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計學分析。計數資料以例數或百分率表示，2組間及多組間比較采用χ2檢驗，多組間中的2組比較采用Fisher檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法；采用Log-Rank檢驗比較FOXF1陰性患者和陽性患者之間總體生存率及無復發生存率的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1腫瘤組織與癌旁組織中FOXF1、E-cadherin和N-cadherin的表達情況 139份腫瘤組織中FOXF1和E-cadherin的陽性率低于癌旁組織(χ2=75.248，P=0.001；χ2=58.082，P=0.001)，腫瘤組織中N-cadherin的陽性率高于癌旁組織(χ2=9.616，P=0.002)。見表1、圖1。

表1 FOXF1、E-cadherin及N-cadherin的表達情況[n(%)]

注：FOXF1主要定位于細胞核，A、B、C為癌旁組織，D、E、F為腫瘤組織，其中A、D、E為FOXF1陰性，B、C、F為FOXF1陽性，箭頭所指為典型區域

圖1 FOXF1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(SP，×200)

2.2乳腺癌組織中FOXF1的表達與腫瘤生物參數的關系 不同腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期的乳腺癌組織中，FOXF1的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)；不同年齡，PR、ER、HER-2表達，組織學類型的乳腺癌組織中FOXF1的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中FOXF1的表達與乳腺癌臨床生物參數的關系[n(%)]

續表2 乳腺癌組織中FOXF1的表達與乳腺癌臨床生物參數的關系[n(%)]

2.3乳腺癌組織中FOXF1的表達與患者預后的關系 FOXF1陽性及陰性表達患者總體生存率分別為95.00%、72.73%，FOXF1陰性乳腺癌患者的總體生存率低于FOXF1陽性乳腺癌患者的總體生存率，差異有統計學意義(Log-Rank檢驗，χ2=8.113，P=0.004)，見圖2。同樣，FOXF1陽性、陰性表達患者無復發生存率分別為95.00%、63.64%，FOXF1陰性乳腺癌患者的無復發生存率低于FOXF1陽性乳腺癌患者的無復發生存率，差異有統計學意義(Log-Rank 檢驗，χ2=4.396，P=0.036)。見圖3。

圖2 不同FOXF1表達的乳腺癌患者總體生存率生存曲線

圖3 不同FOXF1表達的乳腺癌患者無復發生存率生存曲線

3 討 論

FOX基因家族編碼一組擁有叉頭結構域的轉錄因子，這類轉錄因子在胚胎發育過程中有重要作用，同時也調控著細胞周期、細胞生長、細胞代謝和免疫反應等過程[2]。FOX家族的調控失調與許多腫瘤的進展密切相關[6,9-10]。其中FOXF1是FOX家族重要的成員，FOXF1陰性表達小鼠可出現肺部、膽囊、食管、氣管的間充質發育的異常[11-13]。

乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康的疾病，隨著現代醫療手段的進步，乳腺癌患者總體的預后較以往有很大的改善。但是仍有部分乳腺癌容易轉移和復發，且缺乏有效的治療手段，這類患者的病死率很高，因此，揭示乳腺的發病機制，尋找防治的方法具有重要意義。FOXF1在乳腺癌中的研究很少，探討FOXF1在乳腺癌中的作用是一項有創新性的工作。

本研究結果顯示，乳腺癌組織中FOXF1的表達明顯低于癌旁組織，這與其他研究者在前列腺癌、肺癌中的研究結果類似[5,10]。進一步的統計分析結果顯示，139份腫瘤組織中FOXF1和E-cadherin的陽性率低于癌旁組織，腫瘤組織中N-cadherin的陽性率高于癌旁組織，且不同腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期的腫瘤組織FOXF1的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。FOXF1可能與腫瘤增殖有關，與PK等[7]報道在乳腺癌中FOXF1參與調節細胞周期類似；限于患者資料中TNM分期只有Ⅰ～Ⅲ期的資料，沒有遠處轉移的資料，FOXF1表達越低，腫瘤越趨于淋巴結轉移，腫瘤組織中FOXF1表達越低，E-cadherin表達越低，N-cadherin表達越高。最近的研究表明，上皮-間質轉化(EMT)在乳腺癌轉移過程中發揮了關鍵作用，EMT的特征在于上皮標志物如E-cadherin的減少和間質標志物如N-cadherin、波形蛋白和纖連蛋白的誘導增加[14-15]，提示FOXF1可能具有通過EMT過程來抑制腫瘤淋巴結轉移的作用；TNM分期越高，腫瘤組織中FOXF1的陽性表達率也高。以上結果均提示FOXF1參與了乳腺癌的發生、發展。

生存分析結果表明，FOXF1陰性患者總體生存率和無復發生存率明顯低于FOXF1陽性患者，提示FOXF1表達越低，患者預后越差。這些研究結果表明，FOXF1可作為判斷乳腺癌患者預后的標志物。乳腺癌的評估系統結合FOXF1的檢測可能會為準確預測患者的預后和個性化治療方案的制訂提供新的途徑。