傷科解毒顆粒的提取工藝研究

王小新 韋玉燕 何 科

廣西壯族自治區(qū)玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院藥劑科，廣西玉林 537000

目前致病菌的耐藥情況越來越嚴(yán)峻，國家對(duì)于抗菌藥物的監(jiān)管也越來越嚴(yán)格，這對(duì)于抗菌中藥的研發(fā)帶來了很好的機(jī)會(huì)。傷科解毒方是我院根據(jù)骨傷科手術(shù)特點(diǎn)擬定的中藥復(fù)方，是五味消毒飲合桃紅四物湯加柴胡、延胡索而成，用于預(yù)防和治療骨科術(shù)后細(xì)菌感染和下肢靜脈血栓。本方在臨床上已使用多年，治療效果確切，現(xiàn)欲開發(fā)成傷科解毒顆粒，以方便患者服用和攜帶。制劑的提取工藝篩選是以有效成分的最大提取量為目標(biāo)，其中傳統(tǒng)的干膏得率是作為制劑有效成分總提取量的指標(biāo)，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多通路、多靶點(diǎn)治療疾病的特點(diǎn)。高效液相色譜法測(cè)定制劑中的有效成分含量可以考察制劑成分的穩(wěn)定性，具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)[1]。本實(shí)驗(yàn)以干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，對(duì)優(yōu)化傷科解毒顆粒的提取工藝進(jìn)行綜合考察，旨在為其日后的開發(fā)利用提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20高效色譜儀及紫外檢測(cè)器（日本島津）；C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm，武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）；AB201-S型電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1-S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；AK400A型中藥粉碎機(jī)（溫嶺市奧力藥材器械廠）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110753-201415）；所有藥材均購自廣西張益堂中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定均符合《中國藥典》2015年版（一部）標(biāo)準(zhǔn)；高效液相所用乙腈、甲醇均為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 干膏的制作計(jì)算方法

濃縮濾液至100 ml，精密量取20 ml置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05℃烘箱中烘4 h，置干燥缸中冷卻30 min，精密稱重。

2.2 綠原酸的含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件[2]檢測(cè)波長：327 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87）；體積流量：1 ml/min；柱溫：常溫；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 供試品溶液的制備[3-4]精密稱取樣品干膏0.2 g至錐形瓶中，加入50%甲醇溶液100 ml，超聲30 min，過濾，濾液用50%甲醇定容至100 ml，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品，用甲醇制成濃度為15.04 μg/ml的溶液，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn)[5]取高（60.60 μg/ml）、中（20.78 μg/ml）、低 （8.22 μg/ml）3種質(zhì)量濃度的綠原酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD均＜2%，提示儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)[6]精密量取供試品儲(chǔ)備液10 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，測(cè)得綠原酸含量RSD為2.2%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)[7]取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下每3小時(shí)測(cè)定 1次， 即 0、3、6、9、12 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得綠原酸峰面積RSD為1.73%，提示供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)[8]取“2.2.2”項(xiàng)下方法制備的同一批供試液9份，加入相當(dāng)于對(duì)照品溶液80%、100%、120%的量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)得綠原酸的平均加樣回收率為99.91%，RSD為0.79%（表1）。

2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品4.7 mg，置于 25 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻至完全溶解，即得質(zhì)量濃度為0.188 mg/ml的對(duì)照品母液。使用時(shí)用移液管精密吸取對(duì)照品母液2～25 ml的容量瓶，用50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過即得濃度為15.04 μg/ml的對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣 5、10、15、20、25、30 μl， 用高效液相色譜儀測(cè)得綠原酸峰面積。以綠原酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3×106X+1486，r=1。結(jié)果提示綠原酸質(zhì)量濃度范圍在75.2～451.2 μg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 定量測(cè)定 精密吸取供試品溶液20 μl進(jìn)樣，用高效液相色譜儀分析測(cè)得綠原酸峰面積，計(jì)算綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綠原酸對(duì)照品與樣品的色譜圖如圖1。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖

2.3 綜合評(píng)分的計(jì)算方法

根據(jù)處方中各藥味的配比以及作用功效，設(shè)定干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)重權(quán)重系數(shù)為0.7，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3。綜合評(píng)分=干膏質(zhì)量評(píng)分×0.7+綠原酸含量評(píng)分×0.3。 其中干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)評(píng)分為=（x-xmin）/（xmax-xmix），綠原酸質(zhì)量量分?jǐn)?shù)評(píng)分=（y-ymin）/（ymax-ymix），x 為綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，y為干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]。

2.4 單因素考察[11-13]

2.4.1 吸水率考察 取處方量各藥材加10倍水，浸泡24 h，濾過，剩余濕藥材稱重。吸水率（按重量計(jì)算）=（濕藥材總重-干藥材總重）/干藥材總重。計(jì)算結(jié)果吸水率為2.29 g/g。

2.4.2 浸泡時(shí)間考察 稱取處方量各藥材加20倍水，分別浸泡 5、15、30、45、60 min，煎煮 90 min，濾過，濾液按“2.1”所述方法制成干膏，精密稱取0.2 g干膏，按“2.2”所述方法進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取浸泡時(shí)間15、30、45 min作為正交考察水平。

表2 浸泡時(shí)間考察結(jié)果

2.4.3 加水倍數(shù)考察 稱取處方量各藥材，藥材分別加入 18、21、24、28、30 倍水量浸泡 45 min，煎煮 90 min，趁熱過濾，濾液按“2.1”項(xiàng)制作干膏。精密稱取干膏0.2 g，按“2.2”項(xiàng)進(jìn)行高效液相色譜分析，計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取加水量21、24、28倍作為正交試驗(yàn)考察水平。

表3 加水倍數(shù)考察結(jié)果

2.4.4 煎煮時(shí)間考察 稱取處方量各藥材，加24倍水浸泡 45 min，分別煎煮 30、60、90、120、150 min，濾過，濾液按 “2.1”項(xiàng)制作干膏。精密稱取干膏0.2 g，按“2.2”項(xiàng)進(jìn)行高效液相色譜分析，計(jì)算綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取煎煮時(shí)間90、120、150 min作為正交試驗(yàn)考察水平。果選定3個(gè)水平進(jìn)行考察，具體見表5。

表4 煎煮時(shí)間考察結(jié)果

2.5 正交試驗(yàn)

稱取處方量各藥材，按正交試驗(yàn)表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)。考察因素有加水倍數(shù)（A）、浸泡時(shí)間（B）、煎煮時(shí)間（C）和煎煮次數(shù)（D），每個(gè)因素根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)

表5 正交試驗(yàn)的考察因素和考察水平

以干膏的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為考察指標(biāo)，以綜合評(píng)分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表6、表7。

表6 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析

表7 綜合評(píng)分方差分析表

由綜合評(píng)分的直觀分析以及方差分析可知，A因素應(yīng)選取 A2，B因素應(yīng)選取 B3，C因素應(yīng)選取 C2，D因素應(yīng)選取D2，即最佳提取工藝為A2B3C2D2，即加入24倍水量，浸泡45 min，煎煮時(shí)間為2 h，煎煮2次，每次1 h。

2.6 提取工藝驗(yàn)證

稱取處方量各藥材，按上述實(shí)驗(yàn)所得最佳工藝重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，其結(jié)果如表8。3次的提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，各指標(biāo)略高于正交試驗(yàn)，干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.31 g/g和5.44 mg/g，RSD分別為1.9%和3.1%，均＜5%，結(jié)果差異較小，提示正交試驗(yàn)結(jié)果篩選的最佳提取工藝穩(wěn)定可靠。

表8 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

傷科解毒方是我院臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，在五味消毒飲合桃紅四物湯的基礎(chǔ)上加味柴胡、醋延胡索而成。方中五味消毒飲出自吳謙《醫(yī)宗金鑒》，是清熱解毒的著名方劑，由金銀花、紫花地丁、蒲公英、野菊花、青天葵組成，臨床多用于疔毒、癰瘍瘡癤等。文獻(xiàn)報(bào)道，五味消毒飲有廣譜抗菌作用，其水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、四聯(lián)球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌普遍具有抗菌作用[14]。桃紅四物湯源于清初吳謙的《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》，為養(yǎng)血補(bǔ)血活血的基礎(chǔ)方，是遵循“活血化瘀”的原則所組成的治療骨折基本方，實(shí)驗(yàn)顯示，桃紅四物湯能明顯改善骨折早期疼痛、腫脹等癥狀，同時(shí)對(duì)瘀斑、局部壓痛等體征亦有加速恢復(fù)的作用，其作用強(qiáng)于常規(guī)治療組[15]，因此傷科解毒顆粒具有預(yù)防和治療骨科術(shù)后感染及下肢靜脈血栓的雙重功效。開發(fā)傷科解毒顆粒具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在中藥制劑的研發(fā)過程中，以什么指標(biāo)去考察各工藝的水平非常重要。中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制多樣，具有多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，所以干膏得率是衡量中藥物質(zhì)成分的有效指標(biāo)，所以本文選取干膏作為考察指標(biāo)之一，并且給予0.7的權(quán)重系數(shù)，反映了中藥制劑總有效物質(zhì)在治療效果中占的主導(dǎo)作用。中藥制劑中具體有效成分的含量測(cè)定，可以衡量其質(zhì)量是否達(dá)到要求及產(chǎn)品是否穩(wěn)定。高效液相色譜法具有柱效高、靈敏度高、分離速度快、適用范圍廣、重現(xiàn)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[1]，在中藥有效成分的含量測(cè)定中具有突出優(yōu)勢(shì)，成為中藥成分質(zhì)量控制的重要手段。金銀花作為傷科解毒顆粒中的君藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用，其主要有效成分為綠原酸，所以試驗(yàn)以綠原酸的含量作為考察指標(biāo)。參考《中國藥典》2015版中金銀花下綠原酸的色譜條件，對(duì)傷科解毒顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，其綠原酸峰分離度較好，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，故試驗(yàn)選用此色譜條件。本實(shí)驗(yàn)對(duì)干膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩個(gè)考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，篩選最優(yōu)工藝，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，證明最優(yōu)工藝穩(wěn)定可行，可以確保傷科解毒顆粒的有效性，這為后續(xù)的研究提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。