黃連素對2型糖尿病大鼠胸主動脈PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響

封 芬 譚安雄 鄧集湘 周 斌

1.邵陽學院藥學院，湖南邵陽 422000；2.湖南省邵陽市中心醫院內分泌科，湖南邵陽 422000

[關健詞]黃連素；糖尿病；大血管病變；血脂；PI3K；Akt；eNOS

目前，糖尿病的患病率持續增長，2013年，我國成人糖尿病患者已達人口總數的10.4%[1]。大血管病變作為糖尿病的主要慢性并發癥，是患者死亡的主要原因[2]，而血管內皮功能障礙和動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的主要病理表現[3]。近年來的研究顯示，我國傳統中藥黃連素在降血糖、調血脂等方面具有顯著功效[4-5]，黃連素能改善血管內皮功能，減輕動脈球囊引起的血管內皮損傷[6]。縱觀國內外研究報道，對黃連素保護糖尿病大血管方面的信號機制研究較少。有學者發現，肌肉因子Irisin、藻酸雙酯鈉納米劑型、紅景天苷等可通過上調PI3K/Akt/eNOS信號途徑，改善糖尿病血管內皮功能[7-9]，故推測黃連素對糖尿病大血管的保護作用有可能與PI3K/Akt/eNOS信號通路有關。本實驗從黃連素對2型糖尿病大鼠糖、脂代謝及胸主動脈PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響著手，探討其對糖尿病大血管病變的防治機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物和飼料

清潔級 SD 大鼠[60 只，雄性，體質量（190±10）g]、普通飼料、高糖高脂飼料（含58.5%普通飼料、20%蔗糖、18%煉豬油、0.5%膽酸、3%膽固醇）均由湖南長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 主要藥物和試劑

黃連素和鏈脲佐菌素為北京北實縱橫科技發展有限公司產品；鹽酸二甲雙胍為山東東方福瑞達制藥有限公司產品；p-eNOS（Ser1177）一抗和p-PI3K-p85一抗為 Cell Signaling Technology公司產品；p-Akt（Ser473）一抗、山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗為江蘇碧云天生物技術研究所產品；一氧化氮（NO）硝酸還原酶法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PVDF膜和β-actin抗體購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白質檢測BCA試劑盒為Pierce公司產品，ECL化學發光試劑盒為Santa Cruz公司產品。

1.3 主要儀器

日立7020型全自動生化分析儀（日本日立高新技術有限公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），強生穩步倍加型血糖儀（美國Lifescan公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），垂直電泳及轉膜系統（美國Bio-Rad公司），SynergyTM HT多功能酶標儀（Bio-Tek公司），AlphalmagerTM2200凝膠成像系統（美國Alpha Innotech公司）。

1.4 動物造模及分組

將60只SD大鼠隨機分為正常組（n=10）和實驗組（n=50），前者飼喂普通飼料，后者飼喂高糖高脂飼料。4周后大鼠禁食12 h，實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg（用pH為4.4的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解），正常組腹腔注射等量的枸櫞酸緩沖液，7 d后均重復注射1次。2周后，斷尾取血測空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）， 以 FBG≥11.1 mmol/L視為2型糖尿病大鼠造模成功[10]。將30只2型糖尿病大鼠隨機分為二甲雙胍組（陽性對照藥）、黃連素組和模型組各 10 只，分別以二甲雙胍[200 mg/（kg·d）]、黃連素[150 mg/（kg·d）]和生理鹽水[10 mg/（kg·d）]灌胃，每天注意觀察大鼠攝食、飲水、排便等情況，繼續喂養8周。

1.5 生化指標檢測

藥物干預結束后禁食12 h，剪尾采血，用血糖儀檢測FBG。然后麻醉大鼠，腹主動脈取血分離血清，-80℃保存，用于檢測一氧化氮（NO）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平。NO按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測，TC、TG、LDL-c、HDL-c 用全自動生化分析儀進行檢測。

1.6 胸主動脈形態學觀察

腹主動脈取血后即刻分離胸主動脈，剪成兩段，分別予HE染色和-80℃保存。立即將一段胸主動脈予10%中性甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，經蘇木精-伊紅染色（HE染色）后觀察顯微鏡下的形態學改變。

1.7 免疫印跡法檢測胸主動脈p-PI3K-p85、p-Akt、peNOS等蛋白表達

取出低溫保存的大鼠胸主動脈，裂解、冰浴勻漿后，低溫高速離心，去除沉淀，BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液后加熱變性。取50 μg蛋白上樣，在10%SDS-PAGE凝膠上進行電泳。半干式電轉至PVDF膜，5%脫脂牛乳室溫下緩慢輕搖封閉2 h，加入一抗后于4℃孵育過夜。次晨TBST洗膜，10 min/次，共3次。加入二抗，室溫緩慢輕搖孵育40 min，TBST洗膜，15 min/次，共3次。暗室內加入超敏發光劑，X線膠片曝光。用AlphalmagerTM2200凝膠成像系統分析p-PI3K-p85、p-Akt、p-eNOS 等蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗期間大鼠情況

正常組大鼠體質量漸增，皮毛潤滑，攝食飲水量適中，大小便及活動正常。模型組大鼠體質量漸減，毛色枯黃，攝食飲水量及小便增多，精神萎靡懶動。二甲雙胍組和黃連素組大鼠糖尿病癥狀輕于模型組。

2.2 各組大鼠FBG及血清NO水平的比較

模型組大鼠的FBG水平高于正常組，血清NO水平低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；黃連素組及二甲雙胍組的FBG水平低于模型組，血清NO水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）（表 1）。

表1 各組大鼠FBG和血清NO水平的比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠FBG和血清NO水平的比較（n=10，±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） FBG（mmol/L） NO（μmol/L）正常組模型組二甲雙胍組黃連素組--200 150 4.87±1.14 25.23±4.01*11.18±3.01*△13.75±2.84*△35.72±4.35 20.07±3.30*29.02±3.98*△26.56±4.48*△

2.3 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較

模型組的TG、TC、LDL-c水平高于正常組，HDL-c水平低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）。黃連素組及二甲雙胍組的TG、TC、LDL-c水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）。黃連素組的TC水平高于二甲雙胍組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 2）。

表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較（n=10，±s）

與正常組比較，#P＜0.05，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與二甲雙胍組比較，▲P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-c（mmol/L）HDL-c（mmol/L）正常組模型組二甲雙胍組黃連素組--200 150 0.71±0.13 2.22±0.30*1.86±0.25*△1.92±0.20*△1.32±0.11 3.86±0.32*2.56±0.31*△2.82±0.21*△▲1.08±0.11 2.63±0.28*1.76±0.28*△1.94±0.30*△1.11±0.10 0.75±0.09*0.96±0.08#*△0.89±0.08*△

2.4 大鼠胸主動脈形態學觀察

正常組大鼠胸主動脈中膜層彈力板與平滑肌細胞排列有序，內膜平整光滑。模型組內膜不連續且明顯增厚，并有內皮細胞壞死脫落現象。二甲雙胍組和黃連素組病變程度明顯輕于模型組，內膜較光滑平整，內皮細胞壞死脫落較少（圖1）。

圖1 各組大鼠胸主動脈形態學變化（HE染色，200×）

2.5 大鼠胸主動脈p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt蛋白表達

模型組胸主動脈的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表達低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；黃連素組和二甲雙胍組胸主動脈的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表達高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組大鼠胸主動脈p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt等蛋白的表達

3 討論

黃連素具有顯著的抑菌作用，常用于治療細菌性胃腸炎。近年來報道，黃連素也具有內分泌及心血管系統方面的藥理作用[10]。黃連素能明顯降低糖尿病大鼠餐后血糖及空腹血糖[11]，能降低高脂血癥大鼠血脂水平[12]。本實驗通過腹腔注射鏈脲佐菌素，結合高糖高脂飼料喂養的方法建立2型糖尿病大鼠模型[13]。黃連素組大鼠經黃連素治療后，糖尿病癥狀明顯減輕。與模型組大鼠相比，黃連素組的FBG、TG、TC、LDL-c水平明顯降低，HDL-c 水平明顯升高（P＜0.01），提示黃連素具有較好的降血糖及調血脂作用，與國內外報道相似。

NO為血管舒張因子，是反映血管內皮功能的常用指標。研究顯示，糖尿病、高血脂可導致血管內皮功能受損，NO合成分泌減少[14]，而內皮細胞損傷是糖尿病大血管病變的關鍵觸發因素[3]。本實驗模型組大鼠胸主動脈內膜受損明顯，血清NO水平明顯低于正常組，而 FBG、TC、TG、LDL-c 水平明顯高于正常組（P＜0.01），提示在高糖高脂的刺激下，2型糖尿病大鼠出現了大血管病變。與模型組相比，黃連素組大鼠的血清 NO 水平升高，血糖、血脂水平降低（P＜0.01），胸主動脈內皮病變改善，提示黃連素可能通過改善糖脂代謝，緩解血管內皮受損，保護糖尿病大血管。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）是由催化亞基p110和調節亞基p85組成的異二聚體[15]。Akt是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信號通路與糖代謝、細胞增殖、分化等生命活動密切相關[16]。

內皮型一氧化氮合酶 （endothelin nictric oxide synthase，eNOS）是合成NO的限速酶，為內皮功能完整的標志之一[17]。研究顯示，脂肪因子vaspin可通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑改善高葡萄糖誘導的內皮組細胞功能障礙[18]；6-姜酚可通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，減輕高葡萄糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷[19]。上述研究均提示PI3K/Akt/eNOS信號通路與調控血管內皮功能密切相關。據報道，黃連素可通過激活PI3K/Akt/eNOS通路，改善TNF-α引起的內皮祖細胞受損[20]。本實驗中，模型組大鼠胸主動脈的p-PI3K-p85、p-Akt和p-eNOS等蛋白表達低于正常組（P＜0.01），而黃連素組高于模型組（P＜0.01），故推測黃連素可通過激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑，保護大血管內皮功能。

綜上所述，黃連素能保護2型糖尿病大鼠大血管，減輕內皮病變程度，可能與改善糖脂代謝和激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑有關。本實驗僅對此信號途徑進行了初步探討，關于黃連素對糖尿病大血管的保護機制仍需進一步研究，以期為控制和延緩2型糖尿病大血管病變提供理論基礎及實驗依據。