星點設計-效應面法優化清石顆粒醇提工藝

崔亞玲，趙慶春，馬宏達，岳 晶，胡 北，李 昕

0 引言

清石顆粒主要由海金沙、石韋、厚樸、茯苓、萹蓄、茵陳、澤瀉、瞿麥、白茅根、大腹皮、黃芪、烏藥、炙甘草提取精制而成，具有清熱涼血、利濕通淋、排石止痛的功效，主要用于治療泌尿系結石，其療效顯著，在我院泌尿外科臨床應用多年。本研究對厚樸、烏藥、澤瀉選用乙醇提取，采用單因素考察和星點設計效應面法，以厚樸酚、和厚樸酚的含量及出膏率為綜合評價指標，優選清石顆粒醇提工藝，為其工業化大生產制備無糖型顆粒制劑提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-19AD型，Japan Shimadzu)；色譜工作站N2000(浙江大學智能信息工程研究所)；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-D4恒溫水浴鍋(金壇市雙捷試驗儀器廠)；電子分析天平AUW120D(北京島津公司)。

1.2 試藥 厚樸酚對照品(批號：110729-200412)、和厚樸酚對照品(批號：110730-201313)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，Fisher公司)；甲醇(分析純，天津博迪化工股份有限公司)；乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；95%乙醇(分析純，盤錦天源藥業有限公司)；重蒸水(沈陽軍區總醫院自制)；厚樸(批號：20131208)、烏藥(批號：20140405)、澤瀉(批號：20131209)，安國市童鈴藥材有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 Welchrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)為流動相[1]。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取和厚樸酚及厚樸酚對照品，加甲醇溶解并制成含厚樸酚、和厚樸酚各20 μg/ml的混合溶液，即對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品稠膏約0.08 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇100 ml，密塞稱重，超聲處理20 min，放冷恢復至室溫后再次稱重，減少的重量加入甲醇補足，搖晃均勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性(除厚樸)樣品溶液的制備 按制劑處方配比稱取除厚樸外的其他12味藥材，按處方工藝制備成陰性樣品，按“2.1.3”項供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取陰性(除厚樸)樣品溶液，厚樸酚、和厚樸酚混合對照品溶液和供試品溶液各20 μl，進行色譜分析，結果表明，陰性樣品不干擾厚樸酚、和厚樸酚的測定，厚樸酚、和厚樸酚與其他成分或雜質分離良好，結果見圖1。

圖1 厚樸酚及和厚樸酚專屬性圖譜

2.1.6 標準曲線及線性關系考察 精密吸取濃度為2.5、5、10、20、40、80 μg/ml的厚樸酚、和厚樸酚混合對照品溶液各20 μl，進行色譜分析，橫坐標為對照品濃度(μg/ml)，縱坐標為峰面積值，求得回歸方程：Y厚樸酚=20 162 X+12 648，r=0.999 9；Y和厚樸酚=20 962 X+13 270，r=0.999 9。結果表明，厚樸酚、和厚樸酚在2.5～80 μg/ml范圍內均與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取20 μl濃度為20 μg/ml的厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液，連續進樣6次，測得厚樸酚峰面積及和厚樸酚峰面積的RSD分別為0.64%、0.61%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μl，按“2.1.1”項色譜條件分析，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12 h進行色譜分析，測得厚樸酚峰、和厚樸酚峰面積的RSD均為2.52%(n=6)，說明供試品溶液在12 h內穩定。

2.1.9 重復性、回收率試驗 按相關方法操作，重復性試驗結果表明，樣品中厚樸酚及和厚樸酚平均含量分別為20.85、11.06 mg/g，RSD分別為2.64%、2.88%(n=6)；厚樸酚的平均回收率為96.9%，RSD為2.38%(n=6)，和厚樸酚的平均回收率為100.1%，RSD為2.44%(n=6)，均符合要求。

2.2 星點設計-效應面法試驗

2.2.1 提取次數的選擇 采用乙醇回流法制備厚樸、烏藥、澤瀉的提取物稠膏，乙醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數是影響該法提取的主要因素。由于提取次數是非連續變量，不適用于星點設計分析，故對提取次數進行單因素考察[2-3]。

按處方取厚樸、烏藥、澤瀉藥材3份，分別置于圓底燒瓶中，加入10倍量80%乙醇回流提取1 h，分別提取1、2、3次，濾過，取濾液，加熱濃縮至恒重，制得稠膏，按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法制得供試品溶液，并進行色譜分析，厚樸酚、和厚樸酚含量測定結果見表1。結果表明，提取次數為1次時，出膏率最低，厚樸酚、和厚樸酚含量最高，故將提取次數定為1次。

表1 不同提取次數對出膏率及厚樸酚、和厚樸酚含量的影響(n=3)

2.2.2 星點試驗設計 根據星點設計原理，選取乙醇濃度、提取時間、溶劑用量為考察因素，每因素設5個水平，用代碼值-α、-1、0、1、α(α=1.682)表示，因素水平表見表2。分別按星點設計的因素安排試驗，以出膏率、厚樸酚及和厚樸酚總含量為評價指標，并將這兩個指標用Hassan方法標為0～1之間的“歸一值”，以各指標“歸一值”計算幾何平均數，得總評“歸一值”(總評OD值)[4]。試驗安排見表3。

表2 星點設計因素與水平

由表4方差分析結果可知，二次多項式方程的P值<0.001，相關系數R2=0.940 2，說明方程擬合度良好，失擬項P=0.60>0.05，表明該模型能夠較好且誤差較小地反映響應值的變化。且該模型中，X1(乙醇濃度)、X2(提取時間)對醇提工藝的提取得率有顯著影響(P<0.01)，綜上所述，此模型具有顯著的擬合度和預測性，因此，該模型可用于對清石顆粒的醇提工藝進行分析和預測。

2.2.4 效應面優化與預測 根據優化后的二項式擬合方程，在保持1個因素編碼值為0時，應用Design-expert 8.0.6軟件繪制其他2個因素與響應值關系的三維效應面圖，結果見圖2～圖4。基于上述擬合所建立的數學模型，得到最佳提取條件為7.22倍量73.92%乙醇回流提取84.32 min。結合實際生產，本試驗最終選取的工藝條件為7倍量75%乙醇回流提取90 min。

表3 醇提工藝星點設計試驗安排及結果

注：15～19號為重復性試驗

表4 二次多項回歸方程方差分析結果

2.2.5 驗證試驗 按處方配比稱取藥材(n=3)，依據上述預測的最佳提取條件進行驗證試驗。結果其總評OD值分別為0.898 7、0.883 2、0.911 2，而預測總評OD值為0.905 8，偏差率為-0.00 894%，說明所建立的數學模型具有良好的預測性，可用于清石顆粒醇提工藝的優化。

3 討論

3.1 在厚樸酚、和厚樸酚的含量測定方法學建立中，筆者對流動相甲醇-水(78∶22)、甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-水-1%冰醋酸溶液(75∶25)進行了考察[5-6]。結果顯示，以甲醇-水(78∶22)為流動相時，峰形不佳，且陰性有干擾。為改善峰形及分離效果，在2010版《中國藥典》一部厚樸藥材的含量測定項下色譜條件的基礎上，筆者調節甲醇、水的比例，并加入低比例醋酸調節流動相的離子強度。結果表明，以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)、甲醇-1%冰醋酸溶液(75∶25)為流動相時，峰形理想，且陰性無干擾。為免色譜柱鍵合相受損壞而降低柱效，故選用甲醇-0.5%冰醋酸溶液(75∶25)為流動相。

3.2 目前，相對于國內應用較為成熟的均勻設計和正交試驗設計方法，星點設計-效應面優化法能更好地解決試驗精度不夠、條件優選不能靈敏地考察各因素間的交互作用等問題，且因其具有可旋轉性及均勻精度性，使其作為一種新型的試驗設計方法，在藥學領域發揮顯著成效[7-8]。因此，本研究選用星點設計效應面法優化清石顆粒醇提工藝，以乙醇濃度、提取時間、溶劑用量為考察因素，厚樸酚、和厚樸酚的含量及出膏率為綜合評價指標，并采用歸一化幾何平均數法對數據進行處理，消除了因各評價指標單位或量綱不同所帶來的影響[9]，利用軟件建立數學模型，繪制三維效應曲面關系圖，預測并驗證最佳工藝條件，為其工業化生產提供依據。

圖2 乙醇濃度和提取時間對醇提工藝影響的三維效應曲面圖

圖3 乙醇濃度和溶劑用量對醇提工藝影響的三維效應曲面圖

圖4 提取時間和溶劑用量對醇提工藝影響的三維效應曲面圖