銀杏葉提取物的免疫調節作用研究

溫 銳，王 儉

0 引言

銀杏葉性甘、味苦、澀、平，歸心、肺經，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛等功效。研究表明，銀杏葉所含的藥用活性成分較多，包括萜烯酯和黃酮苷等，對多種疾病具有良好的預防和治療作用[1-3]。近年來，因為環境污染、工作壓力激增等因素，臨床實踐中發現，機體免疫異常的患者數量有逐年增加的趨勢。人體免疫功能低下會誘發很多疾病。因此，亟待尋找合適、可有效調節機體免疫功能的藥物。目前，銀杏葉提取物對免疫功能影響的相關報道很少。 本研究擬通過觀察銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠免疫功能的影響，為臨床實踐提供理論依據。

1 材料

1.1 藥品、試劑及儀器 藥品：銀杏葉提取物片(商品名：金納多片，40 mg/片，德國威瑪舒培博士大藥廠，批號：H20090365)；環磷酰胺(200 mg/支，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：H32020857)。試劑：綿羊紅細胞(SRBC)，沈陽市大東區前進生物制劑廠；2,4-二硝基氯苯(DNCB)，南開大學精細化工實驗廠，批號：921020；都氏試劑：碳酸氫鈉1.0 g，氰化鉀0.5 g，高鐵氰化鉀0.2 g，加純化水溶解至1 L，混勻。儀器：CL-770全自動生化分析儀，日本島津公司。

1.2 實驗動物 昆明種小鼠，18～22 g，雌雄各半(中國醫科大學附屬盛京醫院醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK[遼]2003-0013)。

2 方法

2.1 免疫功能低下小鼠碳粒廓清模型 按文獻方法[4]，選取昆明種實驗小鼠50只，雌雄各半，分為空白對照組、模型對照組和實驗組(銀杏葉提取物高、中、低劑量組)，每組10只。實驗組小鼠分別口服灌胃給予銀杏葉提取物40、20、10 mg，空白對照組和模型對照組口服灌胃給予0.5%CMC-Na 20 ml/kg。除空白對照組之外，其余四組均于給藥的第3～5天，腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，每日1次；末次給藥后1 h，小鼠尾靜脈處注射墨汁10 μl/g。注射墨汁2 min(t1)、12 min(t2)后，分別從小鼠眼眶靜脈叢處取血25 μl，溶于3 ml的0.1% Na2CO3溶液中混合均勻。取0.1% Na2CO3溶液作為空白對照，與波長680 nm比色測OD值。最后，將小鼠處死，立即取肝臟和脾臟，去除血污后進行稱重，并按如下公式計算樣品的廓清指數(κ值)及吞噬指數(α值)。

2.2 免疫功能低下小鼠溶血素抗體生成模型 昆明種小鼠，雌雄各半，分組及給藥方法同“2.1”。各組小鼠均于給藥第3天，腹腔注射0.2 ml綿陽紅細胞(SRBC，含量20%)。除空白對照組之外，其他四組均在致敏當日腹腔注射給予環磷酰胺20 mg/kg，連續腹腔注射3 d。末次給藥1 h后，于小鼠眼眶靜脈叢處取血并分離血清。每2 μl血清加1 ml生理鹽水(稀釋倍數500)，再加入0.5 ml 5% SRBC，1 ml的10%豚鼠血清補體。將所得溶液樣本，放于37 ℃恒溫水浴中保溫30 min，最后移至冰浴中使反應終止。以1 500 r/min速度離心5 min，取上清液1 ml并加都氏試劑3 ml，搖勻之后靜置10 min，使用540 nm波長熒光進行比色并讀取吸光度。SRBC半數溶血數值的測試方法為：在0.25 ml 5% SRBC中加都氏試劑至總體積4 ml，測定吸光度值，并計算HC50數值[5]

2.3 免疫功能低下小鼠遲發型超敏反應模型 昆明種小鼠，雌雄各半，分組方法及給藥方法同“2.1”。按照文獻建議方法[6]，各組小鼠背部均皮下注射0.35 mol/L的DNCB丙酮液30 μl致敏；致敏后從第4天開始，各組小鼠連續給藥7 d。除空白對照組外，其余四組均于給藥后第3天、第5天，腹腔注射50 mg/kg的環磷酰胺。末次給藥1 h后，在小鼠右耳廓前后涂抹0.35 mol/L的DNCB丙酮液25 μl激發，16 h后處死，用9 mm打孔器于小鼠兩耳相同部位打下耳片并稱重，用下列公式計算腫脹度。

腫脹度(mg)=右耳片質量(mg)-左耳片質量(mg)

3 結果

3.1 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠碳粒廓清的影響 由表1結果可見，免疫功能低下小鼠口服灌胃給予不同劑量銀杏葉提取物后，小鼠κ值和α值均呈改善趨勢。與模型對照組相比，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組κ值、α值升高(P<0.01或P<0.05)。

表1 銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影響(n=10)

注：與模型對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠溶血素抗體生成的影響 免疫功能低下小鼠口服灌胃給予不同劑量銀杏葉提取物后，HC50均呈升高趨勢。與模型對照組比較，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組對免疫功能低下小鼠的免疫功能改善差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；銀杏葉提取物10 mg/kg 劑量組HC50有升高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表2。

表2 各組小鼠HC50、耳腫脹度比較

注：與模型對照比較，*P<0.05,**P<0.01

3.3 銀杏葉提取物對免疫低下小鼠遲發型超敏反應的影響 免疫功能低下小鼠，分別給予不同劑量銀杏葉提取物后，耳腫脹程度呈加重趨勢，加重耳腫脹程度與劑量呈相關趨勢。與模型對照組比較，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量組均顯著加重由DNCB誘發的耳腫脹(P<0.01或P<0.05)。見表2。

4 討論

自20世紀60年代起，國內外許多學者對銀杏及其提取物的藥理作用進行了大量的研究。研究結果表明，銀杏葉提取物具有擴張腦血管、增加腦血管流量、降低毛細血管通透性、清除自由基等作用，能夠有效治療心腦血管類疾病[7-11]。此外，研究顯示，銀杏葉提取物還具有降低血脂的作用，并可通過改善糖耐量等方式，顯著降低老年患者的血糖代謝及高胰島素血癥[12-13]。近年來，有報道，銀杏葉提取物對于腫瘤細胞也具有一定的抑制作用[14]。

銀杏葉提取物除了具有拮抗血小板活化因子、清除氧自由基和降血脂等作用外，近年來，隨著免疫系統相關疾病發病率逐年升高，其對免疫系統功能的作用也引起了越來越多學者的重視[15]。本研究采用環磷酰胺制作小鼠免疫功能低下模型，從非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫三方面，觀察銀杏葉提取物對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用。結果顯示，與模型對照組相比，銀杏葉提取物40、20 mg/kg劑量對免疫功能低下小鼠具有顯著的改善，這種改善效果呈現劑量依賴性，尤以40 mg/kg組改善效果最為顯著。由本研究結果可見，給予免疫功能低下小鼠適當劑量的銀杏葉提取物，可有效改善其特異性和非特異性免疫功能。

本研究中，我們通過建立不同的免疫功能低下小鼠模型，獲得了銀杏葉提取物可改善免疫功能的結果，為今后其他學者深入開展有關銀杏葉提取物的臨床應用提供了基礎的數據和支持。由于實驗條件等因素的限制，本研究結果只是從免疫功能低下小鼠模型中獲得，銀杏葉提取物調節免疫功能的具體機制，需要在今后深入研究。