嗜熱芽孢桿菌CHB1環糊精酶基因優化及其在畢赤酵母中的表達

陳龍軍， 陳濟琛， 林曉栩，， 邱宏端， 林新堅， 蔡海松*

（1.福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建 福州 350003；2.福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州350108）

環糊精（cyclodextrins，簡稱CD）作為一類重要的工農業原材料，廣泛運用于食品、醫藥、化妝品和環 保 等 領 域[1]。 而 環 糊 酶 （cyclodextrin glycosyltransferase，簡稱CGTase）是生物酶法生產環糊精的重要工業用酶，它屬于α-淀粉酶家族中的一類復合型多功能酶[2]，能夠催化環化反應、歧化反應、偶合反應和水解反應。根據現有的報道，CGTase的獲取方式大致歸納為3種：從自然界中篩選野生菌株；根據基因文庫進行克隆表達；對已知目的基因片段進行蛋白質工程改良。其中野生菌株篩選不僅最為直接有效，而且也是后兩種方式的基礎[3-4]。

盡管不斷有新的CGTase得到分離鑒定，但是天然菌株穩定性差、產酶量低、分離純化困難、不易工業化等缺陷極大限制了CGTase的工業化應用。隨著近代分子生物學及基因工程技術的發展，運用生物工程手段實現CGTase基因的異源超量表達成為國內外研究的熱點。其中原核表達多有報道[5-7]，但真核酵母系統表達CGTase鮮見報道，目前僅見兩篇文獻[8-9]有相關報道，表達效果亦不甚理想。畢赤酵母作為一種高效表達系統，遺傳背景清晰，成功實現了多種外源蛋白質的高效表達，探索環糊精酶在畢赤酵母中表達的可行性具有重要意義。因此作者以前期從嗜熱芽孢桿菌 CHB1中分離獲得的新型環糊精酶基因為基礎，以畢赤酵母GS115為表達系統，通過密碼子優化，比較密碼子調整對環糊精酶表達效果的影響，以期實現其在畢赤酵母的異源表達，為該CGTase的實際應用提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株和質粒嗜熱芽孢桿菌CHB1（含新型環糊精酶基因）、Escherichia coliDH5α：作者所在實驗室保存；GS115、pPICZαA：Invitrogen 公司。

試劑與儀器限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Mark、T4DNA 連接酶：TaKaRa 公司；DNA切膠回收試劑盒、PCR引物、博來霉素及質粒快速提取試劑盒：上海生工股份有限公司；其余試劑均為國產或進口分析純。3-18K低溫高速冷凍離心機：德國Sigma公司；PCR儀：基因有限公司；蛋白質電泳儀：美國BIO-RAD公司；Multiskan FC全自動酶標儀：美國Thermo公司。

培養基

1）地芽孢桿菌CHB1生長培養基（組分g/L）：大豆蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化鈉0.2；pH 7.0。

2）低鹽 LB 培養基（組分 g/L）：胰蛋白胨 10，酵母浸膏5，氯化鈉5；固體培養基添加2 g/dL瓊脂。

3）YPG 培養基（g/L）：胰蛋白胨 20，酵母粉 10，甘油20；固體培養基添加2 g/dL瓊脂。

4）BMGY培養基：蛋白胨20 g，酵母浸出物10 g，加入 500 mL水，121℃滅菌 20 min，冷至室溫加入滅菌的 PBS l00 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過濾除菌），10×GY 100 mL，定容到 1 L；

5）BMMY培養基：蛋白胨20 g，酵母浸出物10 g，加入 500 mL水，121℃滅菌 20 min，冷卻至室溫加入滅菌的 PBS l00 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過濾除菌），甲醇 5 mL，定容到 1 L。

1.2 實驗方法

基因組DNA和質粒的提取地芽孢桿菌CHB1基因組DNA的提取參照Zhou J[10]的方法進行。質粒的提取參照質粒提取試劑盒說明書的方法進行（上海生工股份有限公司）。

野生型環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆根據地芽孢桿菌CHB1環糊精葡萄糖基轉移酶基因（CGT1基因）序列，設計上下游引物如下：

CGT-F1：5'-CTGAATTCGCTGGAAATCTTAAT AAGG-3'（下劃線為限制性酶EcoRI）；

CGT-R1：5'-TGGCGGCCGCGTTTTGCCAATTC ACTATAA-3'（下劃線為限制性酶NotI）；

以地芽孢桿菌CHB1基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增CGT1基因，擴增條件如下：95℃預變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 90 S，30個循環；72℃后延伸 10 min；4℃保存；PCR產物進行1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過膠回收純化PCR產物，16℃下 與pMD18-T載體進行過夜連接，連接產物轉化感受態細胞Escherichia coli DH5α，挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定，同時提取pMD18T-CGT1質粒送至上海生工有限公司測序驗證。

環糊精酶（CGT）基因密碼子優化及克隆根據CGT1的氨基酸組成，考慮畢赤酵母的堿基偏好性[11]，進行密碼子優化，同時在CGT1基因首末端分別引入限制性酶切位點EcoR I及Not I，將優化序列CGT2送至上海生工生物工程有限公司合成，連入pMD-18T載體，構建質粒pMD18T-CGT2。

原始基因與優化基因表達載體及重組菌構建載體 pMD18T-CGT1、pMD18T-CGT2 及 pPICZαA分別用限制性內切酶EcoR I和Not I進行雙酶切，分別膠回收 CGT1、CGT2基因片段及 pPICZαA線性載體；參照TaKaRa公司T4 DNA連接酶使用說明書，將CGT1、CGT2基因片段分別與pPICZαA線性載體混合進行連接反應，連接產物轉化感受態細胞DH5α，經25 μg/mL博來霉素抗性LB平板及菌落PCR鑒定，構建重組酵母表達質粒pPICZαACGT1和pPICZαA-CGT2；同時提取相應質粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗證。

分別用限制性內切酶Sac I、Pme I對重組表達載體pPICZαA-CGT1和 pPICZαA-CGT2進行線性化，膠回收后，利用電轉化方法導入感受態畢赤酵母GS115中，于100 μg/mL博來霉素抗性YPG平板培養至轉化子出現，對轉化子進行PCR驗證。

重組酵母誘導表達CGTase效果比較將篩選獲得的環糊精酶重組工程菌分別接種在含有100 mL YPG培養基的500 mL搖瓶中，在200 r/min、30℃下培養24 h；以5%的接種體積分數接種于含有200 mL BMGY培養基的500 mL搖瓶中，培養至OD600為 6～8。 4℃、5 000 r/min收集酵母細胞，同時補加適量BMMY培養基重懸酵母，以后每24小時取樣測環糊精酶活力，并補加1%甲醇。

環糊精酶搖瓶發酵條件優化為提高環糊精酶在畢赤酵母中的表達效率，作者對影響酵母表達的重要因素（誘導溫度、pH值、誘導甲醇體積分數等）進行優化。將重組菌接種于含100 mL YPG培養基的500 mL搖瓶中。在200 r/min、30℃下培養24 h，以5%的接種體積分數接種到含有BMGY培養基的250 mL的搖瓶中，在200 r/min、30℃下培養24 h；4℃、5 000 r/min收集酵母細胞，同時補加適量BMMY培養基重懸酵母。以后每24小時補加1%的甲醇進行誘導產酶。誘導溫度分別設為22、25、28、30、32 ℃；pH 設置為 4、5、5.5、6、6.5、7 共六個梯度；甲醇體積分數梯度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；誘導表達時間的優化以每24小時取樣測定酶活性、OD600來確定最佳發酵時間。每組設置3個平行實驗，分別測定環糊精酶活性和細胞密度OD600值。

環糊精酶活性測定測定環糊精葡萄糖基轉移酶活力的方法參照甲基橙褪色法[11]并作適當改進。取50 mmol/L pH 6.0磷酸鈉緩沖液配制的3 g/dL可溶性淀粉溶液0.9 mL于試管中，將試管置于60℃水浴鍋內預熱2 min，然后往試管內加入離心得到的發酵液上清液即粗酶液或適當稀釋的純酶液 0.1 mL，反應 10 min，加入 1.0 mL、1 mol/L 鹽酸溶液終止反應，再加入0.1 mmol/L的甲基橙溶液1.0 mL，振蕩混勻后于16℃保溫20 min，用酶標儀于波長505 nm處測定溶液的吸光度并根據空白計算褪色程度（ΔA），最后根據α-環糊精標準曲線計算出α-環糊精的質量濃度。酶活性單位定義為：60℃、pH 6.0 下，每分鐘催化產生 1 μmol α-環糊精所需的酶量為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 嗜熱芽孢桿菌基因組提取及原始環糊精酶基因克隆

以嗜熱芽孢桿菌CHB1的基因組DNA為模板，以CGT-F1和CGT-R1為上下游引物擴增原始環糊精酶CGT1，電泳結果見圖1。擴增獲得大小在2 000 bp左右的特異性DNA片段，與目的基因片段大?。? 031 bp）一致。進一步進行基因測序，結果顯示擴增序列與原始環糊精酶100%一致，至此，成功獲得大小和序列均正確的原始環糊精酶CGT1。將克隆獲得的CGT1與pMD18T連接，通過CGT-F1/CGT-R1引物進行菌落PCR驗證，結果見圖2。在2 kb左右獲得預期大小的DNA片段，經測序后構建獲得克隆載體pMD18T-CGT1。

圖1 嗜熱芽孢桿菌基因組及CGTase基因PCR擴增產物的電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of CGTgene and Gebacillius sp.CHB1 genome

圖2 克隆載體pMD18T-CGT1菌落PCR驗證Fig.2 Colony PCR validation of pMD18T-CGT1

2.2 重組表達載體構建及驗證

以EcoRI和NotI為雙酶切體系，分別對載體pMD18T-CGT1、pMD18T-CGT2 及 pPICZαA 進行雙酶切，回收 2 000 bp（CGT1）、2 000 bp（CGT2）及3 600 bp線性載體pPICZαA。將回收片段CGT1和CGT2分別與線性載體pPICZαA連接，篩選克隆子進行菌落PCR驗證，電泳結果見圖3。出現了預期大小的兩條帶；挑取2、4號克隆子提質粒送上海生工進行測序驗證，由測序結果看出，原始基因CGT1和優化基因CGT2，均正確插入到pPICZαA，成功構建分泌型重組質粒 pPICZαA-CGT1和 pPICZαACGT2。

2.3 重組環糊精酶畢赤酵母工程菌構建及驗證

將重組表達質粒pPICZαA-CGT1和pPICZαACGT2經相應內切酶線性化后，分別電轉化畢赤酵母，提取重組酵母基因組進行PCR驗證，以酵母信號肽為基礎設計上游引物α-factor（5'-CAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATC-3'）， 分 別 以CGT-R1，CGT-R2為下游引物，進行原始基因與優化基因的擴增驗證，電泳結果見圖4。重組酵母可擴增得到大小2 100 bp，與預期大小一致，同時將PCR產物送上海生工進行測序，結果顯示環糊精酶基因已成功整合入酵母染色體，并處于分泌信號肽α因子下游；至此獲得兩株穩定遺傳的環糊精酶重組畢赤酵母工程菌，GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2。

圖3 重組載體pPICZαA-CGT構建Fig.3 Agarose gelelectrophoresisofpPICZαACGT1and pPICZαA-CGT2

圖4 重組酵母基因組PCR鑒定結果Fig.4 PCR of recombinant Pichia pastoris

2.4 重組菌誘導產酶效果比較

以相同的誘導條件，誘導重組酵母GS115/pPICZαA-CGT1與 GS115/pPICZαA-CGT2 表達環糊精酶，比較密碼子優化前后環糊精酶的活性變化。由圖5產酶曲線可看出，誘導96 h后酶活力趨于穩定，經過120 h誘導后，原始環糊精酶CGT1酵母胞外表達活性達到最高，為0.37 U/mL，是張佳瑜[9]等表達的環糊精酶活性的1.6倍。而優化基因CGT2經過120 h后活性達到0.62 U/mL，是優化前CGT1活性的1.7倍，說明通過堿基偏好性的優化，將原始基因中的低頻密碼子優化成酵母表達系統中的高頻密碼子，有利于提高環糊精酶在畢赤酵母中的表達量。

圖5 密碼子優化前后環糊精酶工程菌表達效果比較Fig.5 Comparison of cyclodextrin enzyme activities between GS115/pPICZαA -CGT1andGS115/pPICZαA-CGT2

2.5 重組菌發酵條件優化

對堿基優化后的環糊精酶工程菌GS115/pPICZαA-CGT2進行發酵條件優化，以誘導發酵120 h為最佳誘導時間，優化包括誘導溫度、pH及甲醇誘導體積分數等主要因素，結果見圖6（a）。隨著誘導溫度的提升，環糊精酶活性逐漸升高，當誘導溫度達到28℃，環糊精酶活性達到最大值0.76 U/mL，隨著溫度繼續升高，活性逐漸下降，究其原因可能是高溫加速了酵母自身蛋白酶的表達，導致環糊精酶蛋白被降解。不同pH對酵母表達外源蛋白具有重要影響，結果見圖6（b）。環糊精酶胞外活性隨著pH的逐漸升高，呈現先上升后下降的趨勢，在pH 6.5時，活性達到最高的0.96 U/mL。甲醇作為碳源及誘導劑，其添加量對環糊精酶的表達至關重要。由圖6（c）可知，隨著甲醇體積分數的增加，酶活力及菌體量逐漸增加，當甲醇體積分數大于2%時，酶活力達到最大值，隨后逐漸降低，可能是由于甲醇本身對酵母細胞的毒性，過量的甲醇不利于表達外源蛋白質。通過主要條件的優化，獲得最佳發酵條件：pH 6.5，溫度28℃，甲醇體積分數為每24小時1.5%，誘導120 h酶活力達到1.26 U/mL，是優化前的2倍。

圖6 重組菌的發酵條件優化Fig.6 Optimization of fermentation conditions

3 結語

作者從嗜熱脂肪芽孢桿菌CHB1中擴增獲得新型CGT酶基因全序列，并實現了其在畢赤酵母中的異源表達。原始基因CGT1，在切除其自身信號肽，插入pPICZɑA表達載體的ɑ-Factor信號肽之后，轉化畢赤酵母GS115，獲得了基因工程菌GS115/pPICZαA-CGT1，其胞外環糊精酶活力為0.37 U/mL，高于張佳瑜[9]等表達的環糊精酶活性。堿基密碼子優化后的CGT2，通過同樣手段構建獲得工程菌GS115/pPICZαA-CGT2，其胞外酶活力達到0.62 U/mL，是優化前CGT1活性的1.7倍；進一步對該重組菌進行發酵條件優化，確定最優條件為pH6.5、28℃、200 r/min、每 24小時補加 1.5%的甲醇誘導，120 h后其胞外酶活力達到1.26 U/mL，是優化前的2倍。

許多研究表明，外源基因密碼子優化對提高外源蛋白質表達量具有顯著作用，可提高幾倍甚至數十倍[13-15]。本研究通過畢赤酵母密碼子優化網站（http：//www.kazusa.or.jp/、http：//www.genscript.com等）及趙翔[11]關于畢赤酵母密碼子的分析，對野生環糊精酶基因密碼子在畢赤酵母中的使用頻率進行分析，發現畢赤酵母低頻率密碼子在該基因中所占比例高達11%，經過密碼子優化后低頻密碼子使用頻率降至6%，其酵母表達活性相應提高了1.7倍，說明密碼子優化對CGT的表達效率確實有一定促進作用，但表達仍不甚理想，亦低于前期大腸桿菌的表達效果。進一步通過氨基酸序列分析，發現在環糊精酶AA序列中含有多達11個潛在糖基化位點序列Asn-Xaa-Thr/Ser（其中aa代表所有氨基酸）；這些位點可能導致環糊精酶在畢赤酵母內被過度糖基化，從而影響了環糊精酶的活性。下階段考慮對酶蛋白實施去糖基化改造，考察糖基化對酶活力的具體影響；同時優化其他相關因素如信號肽、表達載體、表達宿主等，最大限度提高其在酵母中的表達效果。另外，鑒于本研究的環糊精酶基因來自芽孢桿菌，考慮通過芽孢桿菌同源表達系統實現該環糊精酶的高效表達，為環糊精酶的實際應用奠定基礎。