沙漠小球藻轉人乳鐵蛋白的電轉優化

汪文倫， 牟 云， 胡夢薇， 許萬云， 嚴 國， 王會敏， 高劍峰

（石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832000）

沙漠微藻的研究開始于20世紀80年代末。有研究表明，在新疆沙漠中生長著百余中藻類，小球藻是其重要的組成部分[1]。小球藻（Chlorella）是一種單細胞綠藻，富含油脂、蛋白質、碳水化合物、維生素、食用纖維、微量元素和其它生物活性物質[2]。有研究表明，通過基因工程手段和誘導條件，它能夠積累大量的油脂酸和藻蛋白[3-5]。因此，小球藻的研究和開發應用越來越受到重視。采用基因工程技術優化小球藻的油脂酸和藻蛋白合成具有重要的科學意義和巨大的應用價值，然而對小球藻而言，還缺乏有效的遺傳轉化方法，成功轉化的報道只有農桿菌介導法[6]，尚沒有報道沙漠小球藻的電擊轉化法的優化研究。

在遺傳轉化中根瘤農桿菌轉染法常用于酵母和植物細胞中[7]，而微藻細胞中常用電轉化法，并且操作簡單、價格低廉、過程易于控制，在適當的電轉化條件下對細胞的傷害小，電轉效率高。目前，電擊轉化也是一種比較成熟轉化方式并成功的應用于等 鞭 金 藻 （Isochrysis sp）[8]、 小 球 藻 （Chlorella vulgaris）[9]、 魚 腥 藻 （Anabaena）[10]、 斜 生 柵 藻（Scenedesmus obliquus）[11]、 杜 氏 鹽 藻 （Dunaliella sallina）[12]和萊茵衣藻 （Chlamydomonas reinhardtii）[13-14]、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）[15]等，并且獲得了穩定的外援基因轉化系統。有文獻表明[16]，電擊后細胞存活率＜50%時，在雨生紅球藻細胞中能實現高效轉化。

作者以小球藻為實驗材料，進行電轉化導入質粒pCAMBIA2300。質粒pCAMBIA2300上含有人乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）和 GFP 以及卡那霉素基因，即pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS。為了檢測質粒pCAMBIA2300是否導入到小球藻細胞中，采用單菌落PCR和熒光倒置顯微鏡檢測轉化效率。為了有利于沙漠微藻轉基因工程改進，作者研究了主要電擊參數和相關因子對小球藻存活和轉化效率的影響，從而建立電轉化體系，以期待指導小球藻的成功轉化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙漠小球藻GTD8A1：作者所在實驗室分離鑒定獲得，采用的培養基為BBM。取對數生長期的藻液，按照10%的接種體積分數接種。培養條件：25℃光照培養箱中培養，光照強度：4 000 Lx，光照周期為光/暗=12 h/12 h靜止培養，每三天手動搖晃一次。

質粒pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS的大小為10 kb左右，由作者所在實驗室保存，在E.coliDH5α培養擴增，采用高純度質粒小提試劑盒提取純化。質粒pCAMBIA2300含有人乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）和GFP以及卡那霉素基因，質粒濃度采用紫外分光光度計儀測定。

主要試劑：山梨醇、甘露醇和HEPES均購自上海生工；質粒小提試劑盒購自北京天根；卡那霉素（Kanamycin，Kan）購自北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：熒光倒置顯微鏡、電擊轉化和PCR儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-HLFOCS驗證通過含有抗性的LB培養基將E.coliDH5α擴增24 h后，采用質粒小提試劑盒將質粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS提取，采用HLF和GFP引物進行PCR檢測，同時送樣測序驗證。

PCR （Polymerase Chain Reaction） 反應體系：ddH2O 8 μL， 單克隆變性液 2 μL， 引物 （GFP-F/GFP-R；HLF-F/HLF-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL，共 20 μL 擴增體系。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應條件：94℃ 3 min；94 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，循環30次；72℃10 min。 擴增后的目的條帶約750 bp，PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應條件：95℃預變性 5 min；95℃ 變性 60 s，62℃退火 40 s，72℃延伸2.5 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增后的目的條帶約2 133 bp，PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

沙漠小球藻GT8A1所用的BBM培養基：NaNO3250 mg/L，KH2PO4175 mg/L，K2HPO475 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO411.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl21.44 mg/L，MoO30.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98%H2SO42 μL/L。（可以在以上組份中加入15～20 g瓊脂，加入蒸餾水補至1 L制成固體培養基，121℃滅菌20 min，4℃保存）。

E.coliDH5α所用的LB培養基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化鈉 10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用2 mol/L NaOH調pH值7.0～7.4之間；同時加入15～20 g瓊脂粉，制成固體培養基；在121℃高壓下滅菌20 min，4℃保存）。

1.2.2 生長曲線的測定小球藻采用BBM培養基進行培養，接種后的細胞濃度為3.2×105個/mL，設置3個平行樣，每隔兩天取樣一次，進行細胞OD680檢測。

1.2.3 電擊轉化過程 取不同培養時間的小球藻細胞3～5 mL（細胞數量控制在 1×108個/mL），在5 000g/min離心5 min，收集小球藻細胞后再用無菌的BBM培養基清洗3次，然后分別在5 000﹑4 000、3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細胞；將收集好的小球藻細胞置于不同濃度的高滲溶液中（甘露醇、山梨醇各100 μL），在冰上處理不同的時間，然后3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細胞，去掉上清液，在沉淀中加入pH 7.2的不同濃度HEPS電擊緩沖液 （取23.8 g HEPES溶于90 mL雙蒸水中，用2 mol/L的NaOH調pH至7.0～8.0，然后用蒸餾水定容至100 mL，過濾除菌，分裝成2 mL/瓶，4℃保存），將藻細胞稀釋成1×108個/mL放置冰上備用；用紫外光處理干凈的電擊杯30 min左右，將其放置在冰上備用；按藻細胞：質粒（不同濃度的質粒）=3∶1的比例混勻樣本加入到電擊杯中，在冰上放置10 min后，在電擊儀上電擊，在不同的電壓條件下電擊，持續時間0.2 s，脈沖距離2 mm；電擊后的藻細胞置于含有3 mL復活培養基的六孔版中，在黑暗的條件下復活24～48 h后，一部分用血球計數板計數，并計算細胞的存活率；一部分在7 000g/min離心1 min收集轉化小球藻細胞，再用無菌的BBM培養基清洗3次，然后分別再5 000﹑4 000、3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細胞，一部分用無菌的ddH2O稀釋后在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光和計數，一部分涂布于含有100 mg/L卡那霉素的BBM固體平板上，篩選單克隆。培養4～6周后會有單克隆長出，然后將平板上所長的單克隆用無菌的牙簽挑起后置于10 μL的ddH2O中，95℃預變性后作為PCR反應的模板，用PCR檢測陽性克隆，PCR條件同上。

1.2.4 單因素實驗設計分別以不同的電壓、培養周期、滲透劑濃度、滲透時間、質粒濃度和電擊緩沖液濃度為單因素進行實驗，根據實驗結果確定正交實驗變量的設計范圍。

1.2.5 正交實驗設計根據單因素實驗結果，選取單因素實驗最適的范圍，設計正交實驗表以獲取最佳的電轉優化體系，結果見表1。

續表1

1.2.6 分析方法將所有電擊轉化后的小球藻細胞24 h復活后，通過梯度離心獲得細胞，用400 μL培養基重懸，取100 μL做細胞計數和熒光倒置顯微鏡計數；然后將300 μL細胞懸液涂布于3個平行的抗性篩選平板中，培養4～6周后有單克隆長出，用滅菌的牙簽挑取單克隆做菌落PCR檢測，檢測結果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR （Polymerase Chain Reaction） 反應體系：ddH2O 8 μL， 單克隆變性液 2 μL， 引物 （HLF-F/HLF-R）2 μL，2 ×Taq PCR MasterMix （TaKaRa，China） 8 μL，共 20 μL 擴增體系。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應條件：95℃預變性 5 min；95℃ 變性 60 s，62℃退火 40 s，72℃延伸2.5 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增后的目的條帶約2 133 bp，PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用PCR手段對遺傳穩定性進行評價：本實驗將獲得的轉化藻株進行傳代培養，每隔兩個月提取其RNA反轉錄后采用PCR技術驗證目的基因（HLF）是否存在，來證明其遺傳穩定性。其中RNA的提取按照TRIZOL的說明書進行；反轉錄采用TAKARA的試劑盒進行，操作按說明書進行；PCR反應體系同上。

2 結果與分析

2.1 質粒載體pCAMBIA2300-35S-HLF-GFPOCS鑒定及其熒光表達

采用PCR和熒光倒置顯微鏡對構建的載體進行驗證和表達，通過PCR獲得HLF和GFP目的基因，其目的條帶大小為2 133 bp和750 bp，見圖1（a）。通過熒光倒置顯微鏡證明了GFP能在小球藻細胞中表達，其中綠色為含有GFP的小球藻細胞，紅色為不含GFP的小球藻細胞，見圖1（b）。實驗結果表明，質粒載體可以用于下面的實驗研究。

圖1 質粒載體pCAMBIA2300-35S-HLF-GFP-OCS鑒定及其熒光表達Fig.1 Plasmid vector of pCAMBIA2300-35S-HLFGFP-OCS isdetectand expressfluorescent protein

2.2 小球藻細胞生長曲線的測定

以小球藻細胞的培養天數為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制小球藻細胞生長曲線，見圖2。由圖2可以看出，沙漠小球藻在培養到第8天開始進入對數生長期，對數生長周期大約為16 d左右，穩定期22 d，在30 d左右出現衰亡期。

圖2 沙漠小球藻細胞生長曲線Fig.2 Growth curve of desert chlorella vulgaris

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 優化電轉擊穿電壓采用不同電壓對小球藻細胞進行電轉化實驗，分別記錄其細胞的致死率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將進行3次重復實驗的結果求平均值,見表2。實驗結果見圖3。可知，最佳的電擊電壓為1 400 V，此時的細胞致死率為56.20%，熒光陽性平均百分率為30.83%，PCR陽性平均百分率為39.56%。

表2 不同擊穿電壓條件下的電轉化效率Table 2 Electrotransformation efficiency was detected in different breakdown voltage condition

圖3 不同擊穿電壓條件下的實驗結果Fig.3 Experimental statistics and results charts under the different breakdown voltage conditions

2.3.2 優化培養周期采用不同培養周期的小球藻細胞進行電轉化實驗，分別記錄細胞的致死百分率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將3次重復實驗的結果求其平均值，見表3。實驗結果見圖4。可知最佳培養周期為8 d，此時的細胞致死率為52.94%、熒光陽性平均百分率為30.20%，PCR陽性平均百分率為38.29%。

表3 不同細胞培養條件下的電轉化效率Table 3 Electrotransformation efficiency was examined under different microalgae cell cycle condition

圖4 不同培養周期的實驗結果Fig.4 Experimental statistics and results charts under different micro-algae cell cycle condition

2.3.3 優化滲透劑濃度采用不同滲透劑濃度對小球藻細胞滲透處理后，進行電轉化實驗，分別記錄其細胞的致死率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將3次重復實驗的實驗結果求平均值，見表4，實驗結果見圖5。可知最適滲透劑濃度為0 mol/L，此時的細胞致死率為53.70%，熒光陽性平均百分率為27.87%，PCR陽性平均百分率為36.17%。

2.3.4 優化滲透時間采用滲透劑對小球藻細胞進行不同時間的處理，然后進行電轉化實驗，分別記錄其細胞的致死率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將3次重復實驗的結果求其平均值，見表5，實驗結果見圖6。可知最佳滲透時間0 h，此時的細胞致死率為51.24%，熒光陽性平均百分率為28.01%，PCR陽性平均百分率為35.55%。

表4 不同滲透劑濃度條件下的電轉化效率Table 4 Electrotransformation efficiency was detected under different osmosis buffer concentration condition

圖5 不同滲透劑濃度的實驗結果Fig.5 Experimental statistics and results charts under different osmosis buffer concentration condition

表5 不同滲透處理時間條件下的電轉效率Table 5 Electrotransformation efficiency was obtained the samepenetrant osmosistreatmentChlorella Vulgaris under different time condition

2.3.5 優化電擊緩沖液濃度對處理好的小球藻細胞添加不同濃度的電擊緩沖液，然后進行電轉化實驗，分別記錄其細胞致死率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將3次重復實驗的結果求其平均值，見表6，實驗結果見圖7。可知最適電擊緩沖液濃度為0.1～0.2 mol/L，此時的細胞致死率為51.16%～53.64%，熒光陽性平均百分率為26.35%～26.38%，PCR陽性平均百分率為33.47%～33.81%。

圖6 不同滲透劑處理時間的實驗統計和結果統計圖Fig.6 Experimental statistics and results charts under different time of osmosis treatment condition

表6 不同電擊緩沖液濃度下的電轉化效率Table 6 Electrotransformation efficiency was obtained under different electroporation buffer concentration condition

圖7 不同電擊緩沖液濃度的實驗結果Fig.7 Experimental statistics and results charts under different electroporation buffer concentration condition

2.3.6 優化質粒質量濃度對處理好的小球藻細胞添加不同質量濃度的質粒，然后進行電轉化實驗，分別記錄其細胞的致死率、熒光陽性百分率和PCR陽性百分率，將3次實驗的結果求平均值，見表7，實驗結果見圖8。可知隨著質粒質量濃度的增加，熒光陽性百分率和PCR陽性百分率都在增加，其最小值分別為22.02%和28.98%。

表7 不同質粒質量濃度條件下的電轉化效率Table 7 Electrotransformation efficiency was detected under different plasmid concentration condition

圖8 不同質粒質量濃度的實驗結果Fig.8 Experimental statistics and results charts under different plasmid concentration condition

2.4 正交實驗確定最優電轉體系

通過單因素水平的優化實驗結果，作者對各個因子選取五個水平設計了六因素五水平的正交實驗表進行相關的實驗，以獲取最優的電轉化組合。通過對實驗數據的各因素進行極差分析得到：最優的電轉化組合是電壓1 400 V、培養周期8 d、滲透劑濃度0.2 mol/L、滲透時間為0 h、質粒質量濃度為6 μg/mL、電擊緩沖液濃度為0.4 mol/L，其細胞致死率為51.30%，熒光陽性平均百分率為52.54%，PCR陽性平均百分率為42.30%。

2.5 采用PCR手段對遺傳穩定性進行評價

對本實驗所獲得轉化藻株進行擴大培養，每隔兩個月取50 mL的培養液離心后提取RNA，反轉錄后檢測其HLF的遺傳穩定性。實驗結果表明，HLF基因能在沙漠小球中傳代保存六個月以上，具有相對的遺傳穩定性，實驗結果見圖9。

圖9 采用PCR手段對遺傳穩定性進行鑒定Fig.9 Genetic stability of recombinant desert Chlorella was detected with PCR

3 結 語

作者優化了小球藻電擊轉化的條件，并獲得最佳的電擊轉化條件，在該條件下獲得較高的轉化水平，其熒光平均百分率高達42.30%、PCR陽性平均百分率高達52.54%。在整個電擊轉化的過程中，通過細胞的預處理和轉化后細胞的恢復，利用PCR技術和激光共聚焦技術檢測獲得比較成功的轉化體系，而該體系也在其他藻類中被證明。

電擊轉化參數是轉化過程中最主要的影響因素之一，例如像細胞的細胞壁、電壓的大小、質粒濃度的大小、細胞活力等。克服這些影響因素的障礙主要有兩種方法。第一種就是改變細胞壁的通透性，來增加質粒DNA進入細胞的幾率。本實驗研究結果表明，改變細胞壁的通透性可以增加電轉化的效率，特別是在甘露醇、山梨醇和HEPES[17-19]處理細胞和在有適當卡那霉素[20]篩選的條件下，可以獲得較高的電擊轉化效率。第二種方法就是施加高電壓的脈沖，這種方法可以增加細胞膜的通透性從而有效的轉移質粒載體。我們結合這兩種解決方法的影響因素，進行了相關的實驗條件的優化，實驗結果表明，電壓、細胞培養周期、滲透劑濃度和滲透時間等對電轉化效率起到重要作用。

細胞成功轉化的另一個主要的影響因素是細胞的生長階段，當細胞進入到對數期時，細胞對電壓特別靈敏，容易受到電壓的電擊而死亡，但是存活下來的細胞卻有較高的轉化率[21]。為了證實生長周期對電擊轉化的電轉化效率都要比對數期的要低，而在對數期時間段中，對數前期的電轉化效率比對數后期要高。考慮到這過問題，我們在轉化細胞的后期培養過程中加入卡那霉素進行培養而獲得最大的電擊轉化效率。

有研究[22]表明，電轉化需要較高濃度的滲透體系，例如用山梨醇、甘露醇處理細胞可以明顯地改善細胞的轉化效率。我們利用山梨醇和甘露醇的混合滲透體系，在0.1～0.2 mol/L之間都獲得30%以上的轉化效率。在有相同濃度的HEPES電擊緩沖液條件下，電擊轉化效率也能達到30%以上。這很可能是山梨醇、甘露醇和HEPES對細胞的轉化提供保護，降低了電擊電壓對細胞的損傷幾率，這與以往在其他物種上的研究結果相似[8，23-25]。試驗中使用滲透緩沖液和電擊緩沖液處理了電擊體系，增加了轉化效率，也保證了實驗的重復性。在我們的實驗中，我們發現在不同的滲透劑濃度和不同的滲透處理時間上，細胞的轉化效率隨濃度和時間的改變呈遞減趨勢，符合變化趨勢。而電擊緩沖液濃度處理的細胞的轉化效率是先增加后下降最后又上升，這結果經三次重復實驗驗證。

本實驗的研究結果表明，質粒質量濃度對電轉化效率似乎有著不一樣的敏感性，質粒可以被輕松的轉化進入到細胞中。質粒質量濃度從2 μg/mL到10 ug/mL變化時，電轉化效率呈先上升后下降的趨勢，或者是呈下降趨勢。這可能是在電擊轉化體系中對細胞存活有一些影響而造成[26-28]。而我們的實驗結果剛好和已報道的結果[29]相反，我們的實驗結果是隨著質粒質量濃度的上升，電轉化效率也上升，造成這樣的原因可能是滲透處理過的細胞在電壓導流下比較容易進入到細胞中，再者就是沒有必要進行感受態的制備，有的報道中也證實質粒DNA是伴隨著電流進入細胞的[16，19，27，30-32]，這與我們的實驗結果相似。本實驗的反應體系中除含有處理細胞核質粒DNA之外，我們還加入滲透緩沖液和電擊緩沖液，使得質粒DNA能夠以穩定的轉化進入到細胞中，從而獲得比較高的轉化效率。我們實驗獲得了一個比較優化的轉化體系，能夠獲得較高遺傳轉化效率的菌株。同時我們將轉化的藻株進行傳代培養的遺傳穩定性的研究，研究結果表明，HLF基因可以在轉化藻細胞中保存六個月以上。

我們首次在單細胞的沙漠小球藻上建立了比較完整的遺傳轉化體系，對沙漠小球藻而言，這樣高效和可重復的轉化體系還是非常少見。我們在試驗中獲得電擊轉化的最佳組合和相關的轉化體系，該體系簡單、方便、節約時間，更重要的是該轉化體系可以擴展到其他藻類遺傳轉化研究中。我們希望優化改造的電擊轉化體系可以運用到藻類的經濟開發和遺傳轉化研究方面。