Bacillus sp.肌氨酸氧化酶的脫輔基與重構

王 慶， 辛 瑜， 楊海麟， 仝艷軍， 王 武

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

肌氨酸氧化酶 （Sarcosine oxidase，EC.1.5.3.1，SOX）屬于黃素蛋白氧化酶類，以FAD為輔因子，催化肌氨酸中N-甲基的氧化還原[1]。檢測血清或尿液中肌酐的含量，是判斷腎功能的一項重要指標，而SOX則是此項檢測的關鍵診斷用酶之一[2]，在酶法測定中，肌酐轉化為肌氨酸，然后在肌氨酸氧化酶（SOX）的作用下分解成甘氨酸、甲醛和H2O2[3]，催化機理見圖1。

圖1 肌酐降解酶系的催化機理Fig.1 Catalysis in creatinine degradation enzyme system

現代臨床檢測肌酐的方法主要是基于上述酶促反應機理。SOX的酶學性質將在很大程度上影響它的應用價值[4]。作為典型的、以共價結合FAD為輔因子的SOX，其輔基與酶蛋白的復合狀態直接影響到此類酶的活性與特異性[5]。為SOX脫去輔基再復合的研究并不多見，解決共價結合型輔基的脫除尤為困難[6-7]。本研究探索出采用不含輔因子FAD的SOX包涵體復性的方法，對肌氨酸氧化酶進行脫輔基以及與天然輔基的復合，探究如何在復性的過程中添加輔因子[8]，促使酶蛋白本體在正確折疊的過程中螯合輔因子，并呈現出酶學活性[9]。研究SOX酶蛋白與不同的、潛在的輔基之間存在著什么樣的關系，對改造乃至提高此類黃素酶的催化特性，將提供有意義的參考價值[10]。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coli BL21（DE3）/pET28a-soxopB：由作者所在實驗室保存[11]。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基（g/L）胰蛋白胨10，酵母提取物 5，氯化鈉 10，瓊脂 20；pH 7.5。

1.2.2 發酵培養基（g/L）胰蛋白胨10，酵母膏5，KH2PO42，K2HPO4·3H2O 4，NH4Cl 0.2， （NH4）2SO41.2，Na2HPO4·12H2O 7，MgSO4·7H2O 1， 葡萄糖 0.5；甘油10 mL/L。121℃下滅菌20min。

1.2.3 乳糖誘導液（g/L） 乳糖200；115℃滅菌30 min。

1.3 主要試劑

β-巰基乙醇、FAD （黃素腺嘌呤二核苷酸）、FMN（黃素腺嘌呤單核苷酸）、肌氨酸氧化酶、FMN（黃素腺嘌呤單核苷酸）：Sigma 公司；Tryptone、Yeast Extract、GSH、GSSG、核黃素、卡那霉素、牛血清蛋白（BSA）、辣根過氧化物酶：上海Sangon公司；尿素等其他試劑均為國產分析純。

1.4 方法

1.4.1 SOX包涵體的制備粗提取將新鮮活化菌種接種于LB發酵培養基（含1%卡那霉素），在 37℃、200 r/min的搖床中振蕩培養8 h后，加入終濃度為5%的乳糖誘導劑誘導 16 h，然后離心去上清液，在20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液中進行冰浴超聲波破碎，破碎完成后于8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，得到肌氨酸氧化酶包涵體。

1.4.2 SOX包涵體的溶解將洗滌后的包涵體加入到 20 mmol/L Tris-HCl（pH 值 8.0，含 8 mol/L尿素，15 mmol/L β-巰基乙醇）配制的溶解液中，在200 r/min的搖床中過夜，過夜后10 000 r/min離心15 min，取離心后的上清液即為肌氨酸氧化酶包涵體溶解液。

1.4.3 SOX包涵體的透析復性將SOX包涵體變性溶解液置入透析袋中進行復性，通過預實驗先探究復性的基本條件：如蛋白質質量濃度、溫度、氧化還原態、pH、時間等，確定SOX透析復性的最適條件后，加入輔基FAD復性，并按一定的時間間隔取樣測酶活性。

1.4.4 SOX脫輔基蛋白與輔酶復合的條件將SOX包涵體變性溶解液置入透析袋中，按照實驗前期探索的最佳復性條件進行，如蛋白質質量濃度0.3 g/L，透析液pH 8.5，溫度4℃，氧化還原值（GSH/GSSG）為2，復性時間為24 h等，加入的輔因子換為FMN、核黃素（均為4 mg），另外設置不添加任何輔因子的作為對照，比較不同天然輔基與SOX蛋白復合后酶活、結構與熱穩定性的變化。

1.5 分析測定方法

1.5.1 蛋白質質量濃度采用考馬斯亮藍法測定質量濃度，以牛血清白蛋白為標準物，按照標準方法進行測定。

1.5.2 酶偶聯分光光度法測定SOX酶活力以肌氨酸為底物，按照文獻[12]進行測定。

2 結果與討論

2.1 不同因素對SOX包涵體復性的影響

2.1.1 變性可溶蛋白質質量濃度對SOX后期復性的影響用變性液將包涵體的蛋白質質量濃度調制為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mg/mL， 要使溶解液中尿素的濃度不能改變，否則會導致復性過程中蛋白質的沉淀。在室溫下（15℃）透析開始時透析外液中加入6 mol/L的尿素，并添加過量的FAD，加入氧化還原態（GSH/GSSG）比值為 3的GSH與GSSG，以后每隔4小時將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加4 mg的FAD），復性結束后取樣測定SOX的比酶活，見圖2。

圖2 蛋白質質量濃度對復性后SOX比酶活的影響Fig.2 Effects of protein concentration on the specific activity of refolded SOX

從圖2可以看出，在蛋白質質量濃度為0.1mg/mL時復性后的酶比活性最高，變性蛋白質的質量濃度越低，越有利于復性。但初始蛋白質質量濃度太低，復性后的蛋白質質量濃度也比較低，不利于活性蛋白質的回收。且在蛋白質質量濃度為0.8 mg/mL時蛋白質產生部分沉淀，所以蛋白質質量濃度不宜過高，但考慮到后期工作的復雜性，復性時蛋白質質量濃度不能過低，所以取0.3 mg/mL。

2.1.2 復性時間對SOX比酶活的影響使包涵體的蛋白質質量濃度為0.3 mg/mL，室溫下（15℃）首次透析時在透析外液中加入6 mol/L的尿素，以后每隔不同時間（1、2、4、6、8 h）將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），加入氧化還原態 （GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，復性結束后取樣測定SOX的比酶活，見圖3。

圖3 復性時間與復性后SOX比酶活的關系Fig.3 Relation of renaturation time to the specific activity of refolding SOX

由圖3可知，復性時間為24 h比酶活比較高，到了32 h，比酶活雖然還在增長但幅度比較小，而且酶復性時間太久，SOX蛋白質分子之間聚集，活性容易下降，故應選擇復性時間為24 h為宜，即每隔6小時更換不同濃度的復性緩沖液。

2.1.3 復性溫度對SOX比酶活的影響使包涵體的蛋白質質量濃度為0.3 mg/mL，首次透析時在透析外液中加入6 mol/L的尿素，以后每隔6小時將透析外液中尿素的濃度遞減2 mol/L（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），加入氧化還原態（GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，透析24 h后取樣測定SOX的比酶活，研究3個復性溫度對SOX重折疊的影響，見圖4。

圖4 不同溫度對復性后SOX比酶活的影響Fig.4 Effect of different temperatures on the specific activity after refolding of SOX

由圖4可知，在4℃條件下復性的SOX的活性和質量回收率均高于在15℃和25℃下復性的SOX。導致這種現象出現的原因是SOX變性溶解液在重折疊的過程中，分子內部的疏水基團有機會暴露在外界環境中，分子內部或者不同分子之間的疏水基團時時刻刻都在發生布朗運動，溫度升高時布朗運動加劇，導致暴露在外的水基團互相碰撞形成了不正確的折疊造成聚集的產生。而低溫時布朗運動速度慢，疏水基團就不容易發生接觸形成聚集體。

2.1.4 透析液pH對SOX比酶活的影響復性透析液的pH值必須在7.0以上，可以促進二硫鍵的正確形成[13]，在前面的研究條件下，使透析液的pH分別為 7.0、7.5、8.0、8.5 和 9.0，加入氧化還原態（GSH/GSSG）比值為3的GSH與GSSG，在4℃下復性24 h（每次換液時都需要添加2 mg的FAD），結束后測定蛋白質質量濃度和活性，考察透析液pH值對蛋白質復性的影響，見圖5。

圖5 透析液pH對復性后SOX比酶活的影響Fig.5 Effect of dialysis pH on the specific activity of refolding SOX

研究顯示，透析液pH為8.5的條件下復性效果最好，而導致這種現象的原因是SOX變性溶解液在重折疊的過程中，分子內部的二硫鍵的正確折疊起著非常重要的作用，而過高或過低的pH會影響二硫鍵的狀態，二硫鍵復性時最適宜的復性pH值一般為8.0～9.0，結合實驗結果選擇pH為8.5較為適宜。

2.1.5 透析液氧化還原態（GSH／GSSG）對復性SOX的影響氧化還原電勢對于形成正確的二硫鍵非常必要。氧化還原電勢過小，二硫鍵不會產生；氧化還原電勢過高，二硫鍵的形成容易出問題。首先確定GSSG濃度為1 mmol/L，分別加入GSH，使其與GSSG 摩爾比為 0.25、0.5、1、2、3、5， 考 察 GSH 與GSSG比例對SOX復性的影響，見圖6。

圖6 氧化還原環境對復性后SOX比酶活的影響Fig.6 Redox environment after refolding SOX specific activity

圖6顯示，在添加2 mmol/L的GSH條件下復性效果有明顯提高，因此選擇GSH/GSSG為2。

2.2 不同天然輔基與SOX脫輔基蛋白復合的研究

2.2.1 圓二色譜檢測不同輔基與脫輔基SOX的復合通過上述透析復性得知，在復性的過程中添加2 mg的FAD作為輔基可以使酶結構正確折疊，使得315位的Cys與FAD輔因子通過二硫鍵結合。為了判斷不同天然輔基與脫輔基蛋白的復合是否成功[14]，在透析復性過程中分別加入4 mg不同的輔基，如FAD、FMN、核黃素，不加任何黃素輔基的設為空白，采用CD分析不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復合前后二級結構的變化，不同天然輔基與酶復合的圓二色譜見圖7。

圖7 不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復合的CD分析Fig.7 CD analysis on SOX protein complexed with different natural cofactors

圓二色譜分析脫輔酶蛋白與天然輔基復合后的二級結構特征峰與游離酶相比完整性降低，酶分子內部α-螺旋和β-折疊比例降低，二級結構有所變化，其中添加類似物為FAD與FMN的二級結構峰的完整性沒有太大變化，酶活相差不大；而核黃素和未加任何天然輔基的二級結構峰的完整性發生巨大變化，α螺旋和β-折疊比例大幅度降低，酶活相差比較大，說明酶的二級結構遭到破壞，SOX酶分子處于變性狀態。

2.2.2 FTIR分析SOX復合度的變化采用FTIR分析不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復合前后其官能團的變化，判斷不同天然輔基與脫輔基蛋白的復合是否成功。不同天然輔基與酶復合的紅外光譜圖譜見圖8。

圖8 不同天然輔基與肌氨酸氧化酶脫輔基蛋白復合的FTIR分析Fig.8 FTIR analysisofdifferentnaturalcofactor complexed with SOX apoprotein

由圖8，未添加任何配體的SOX分子中2 500 cm-1左右處出現巰基（-SH）伸縮振動峰，該特征峰在經過復性后明顯增強，說明無輔基酶分子中可能生成另一個二硫鍵，使酶分子結構發生改變，復性未成功[15]；添加FAD與FMN作為配體的酶分子波峰結構未發生比較大的變化，輔基的加入促進了酶的正確折疊，結合酶活可證明FAD作為輔基與SOX復性成功，而FMN與脫輔基蛋白不能很好的結合，復性不完全。核黃素在2 100 cm-1左右處出現羧基（—COO—）中C=O伸縮振動峰，此特征峰強度在復合酶中明顯降低，說明羧基載體中羧基含量降低，穩定性下降。3 100 cm-1是NH伸縮振動，此特征峰強度在復合酶中明顯降低，說明氨基載體中氨基含量降低，結合酶活顯示只能少部分復性成功。

2.2.3 DSC分析比較SOX游離酶與復性酶的熱變性利用DSC技術，分析SOX游離酶與復性酶其熱變性溫度Tm的變化，分析兩者的結構穩定性。

如圖9所示，游離酶和復性酶出現了單一的吸熱峰，該吸熱峰則表示分子在升溫過程中構象改變伴隨著能量變化。游離酶和修飾酶的熱變性溫度Tm分別為64.03℃和44.6℃，相同的升溫速率，復性酶的Tm值比游離酶大約降低20℃；與游離酶相比，瓦解復性酶的天然結構要花費更少的能量；兩者數據表示，復性后的SOX酶分子變得不穩定，容易受外界影響。

圖9 游離酶與重構酶的DSC分析Fig.9 DSC thermograms of SOX without cofactor and SOX refolded

3 結 語

作者利用不含輔因子的肌氨酸氧化酶（SOX）包涵體，通過透析復性處理，確定了較為合適的條件：酶蛋白質質量濃度為0.3 g/L，透析液pH為8.5時，溫度 4℃，最佳的氧化還原態（GSH/GSSG）GSH/GSSG值為2，以及復性時間為24 h時，SOX酶蛋白的復性效果相對較好。

研究進一步比較了各種天然輔基與SOX酶蛋白的復合，發現外加FAD（非共價的情況下）與脫輔酶蛋白復合后，酶活性高；二級結構與原酶接近，酶活是原酶的50%；與原酶的α-螺旋與β-折疊的二級結構相似度達80%。FMN的效果次之，酶活是原酶的30%，α-螺旋與β-折疊的二級結構相似度為50%；而加入核黃素后SOX酶分子處于變性狀態，其對SOX酶的復性和酶活皆為負影響。