消腫止痛液有效部位軟膏的制備工藝及其質量標準研究

李曉

1.銀川市中醫醫院，寧夏 銀川 750001；2.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750001

痔瘡是肛腸科多發病，寧夏回族自治區地處西北，人們喜食牛羊肉、善飲酒等生活習慣導致痔瘡發病率較高。據流行病學研究[1]，該地區痔瘡患病率高達40.06%。消腫止痛液(批準文號：寧藥制字Z20140005)是銀川市中醫醫院肛腸科臨床使用二十多年的醫院制劑，主要由地榆、黃柏、大黃等八味中藥組成，用于治療各種原因所致的痔瘡初期及外痔、混合痔、肛裂和痔瘡術后的消腫止痛，療效確切[2]。我院制劑中心對其進行了洗液制備工藝[3]和薄層鑒別研究。隨著生活節奏的加快，外用洗劑攜帶不方便，使用方法繁瑣以及存儲困難，不能滿足患者需求，軟膏制劑使用和攜帶方便，患者依從性好，因對消腫止痛液進行二次開發，旨在開發療效確切，使用便捷的軟膏制劑。前期通過對消腫止痛液的各部位成分進行富集，藥效篩選得到有效部位，本論文將對有效部位軟膏的制備工藝和質量標準進行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；XA105型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；YP4002型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；JJ-1型精密增力電動攪拌器(金壇市城西崢嶸試驗儀器廠)；DZTW型調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠)；TGL-15B型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 材料 消腫止痛液有效部位(銀川市中醫醫院制劑中心實驗室自制)；硬脂酸(批號：101820150901，湖南爾康制藥股份有限公司)；羥苯乙酯(批號：103620170605，湖南爾康制藥股份有限公司)；三乙醇胺(批號：20170401，成都華邑藥用輔料制造有限責任公司)；甘油(批號：000120161004，湖南爾康制藥股份有限公司)；沒食子酸(批號：110831-201605，純度90.8%)、鹽酸小檗堿(批號：110713-201212)、大黃素(批號：110756-201512)、大黃對照藥材(批號：121249-201304)、黃柏對照藥材(批號：121510-201606)均購于中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)。所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 基質類型考察及藥物準備 消腫止痛液有效部位軟膏用于肛周局部給藥，根據給藥部位特點，肛周皮膚濕性重，并易產生分泌物[4]，故選用O/W乳膏基質，不僅可吸附分泌物，還具有易于涂布和清洗的特點。參考《寧夏醫院制劑規范》收載的“乳膏基質1號”進行基質優化。消腫止痛液有效部位藥物細粉，過六號篩，備用。

2.2 乳化工藝考察[5]

2.2.1 試驗方法與質量評價指標

2.2.1.1 離心試驗高度比(Y1) 按正交試驗設計制備軟膏，分別稱取樣品20 g，置于內徑為1 cm離心管中，以4000 r/min的轉速離心30 min，取出，測量離心管中分離出的油層高度(Ho)、水層高度(Ha)及總高度(Ht)，計算高度比(Y1)。計算公式:Y1=(Ho+Ha)/Ht

2.2.1.2 高溫試驗高度比(Y2) 按正交試驗設計制備軟膏，分別稱取樣品20g，置于內徑為1 cm的試管中，于60℃水浴靜置5 h，測量離心管中分離出的油層高度(Ho)、水層高度(Ha)及總高度(Ht)，計算高度比(Y2)。計算公式同上。

2.2.1.3 綜合評分 將Y1、Y2歸一化為評價指標Y進行綜合評分。兩個指標的權重系數均為0.5，當軟膏中油、水兩相完全分層時，Y1或Y2值為1，Y1和Y2越小越好，即綜合評分(Y)=[(1-Y1i)×0.5+(1-Y2i)×0.5]×100。

2.2.1.4 正交設計 根據前期預試驗結果，采用L9(34)正交設計，以藥物與基質比例(A)、乳化時間(B)和乳化溫度(C)為影響因素，以離心試驗高度比(Y1)和高溫試驗高度比(Y2)綜合評分，并結合軟膏的外觀形狀對其質量進行評價，優選消腫止痛有效部位軟膏乳化工藝。

2.2.2 試驗結果與數據分析 按“2.2.1”項下方法進行離心試驗和高溫試驗，正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.0；F0.01(2，2)=99.0。

綜合評分越高，表明軟膏的穩定性越好，表3方差分析結果顯示A因素對離心試驗和高溫試驗結果有統計學意義，且A3>A2>A1，即藥物與基質比第3水平1∶9最為適宜；B和C兩個因素試驗結果無統計學意義，且B3>B2>B1，C3>C2>C1，因此軟膏乳化時間第3水平即30 min，加熱溫度為90 ℃，考慮實際生產溫度控制，故溫度控制在80 ℃較為合適。由此可知消腫止痛液有效部位軟膏的最佳制備工藝為硬脂酸、石蠟、液體石蠟80 ℃共融作為油相；三乙醇胺、甘油、羥苯乙酯溶液(5%)、水共同加熱至80 ℃作為水相，同時將藥物細粉與基質按1∶9加入少量乙醇超聲溶解，趁熱加入水相，水相倒入油相，攪拌30 min，放冷至室溫即得。

2.3 驗證試驗 按上述制備工藝平行制備3批消腫止痛液有效部位軟膏，處方量為100 g，并按“2.2.1”項下方法進行離心試驗和高溫試驗，從兩相的分層情況、外觀(顏色均勻度、軟硬度及細膩程度)評價軟膏制備工藝的合理性。結果表明，3份樣品經高溫、離心試驗后均無分層，外觀各項均符合要求。

2.4 大黃的鑒定[6]取軟膏5.0 g，加入40%乙醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣用1%氫氧化鈉溶液調節pH至9～10，用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液，水層加入鹽酸2 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。按處方稱取缺大黃的其他藥材，分離得到有效部位藥物，并按軟膏制備工藝制成缺大黃的陰性樣品，同法制備缺大黃的陰性對照溶液。另取大黃對照藥材0.10 g，同法制成對照藥材溶液。再稱取大黃素，用甲醇配制成65.23 μg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述四種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視，再置于氨蒸氣中觀察斑點顏色變化。結果，供試品色譜中在與對照藥材色譜對應處，可見5個斑點顯橙黃色熒光；在與對照品色譜對應處，可見相同顏色的斑點；用氨蒸氣熏蒸后，可見斑點顯紅，陰性無干擾，見圖1。

2.5 黃柏的鑒別[7-8]供試品溶液制備方法同“2.4”項下第一次乙酸乙酯振搖萃取后即合并提取液，蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液，同法制備缺黃柏的陰性對照溶液，另取黃柏對照藥材0.10 g，同法制成對照藥材溶液。再稱取鹽酸小檗堿，用甲醇配制成55.63 μg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述四種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(10∶5∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。結果，供試品色譜中在與對照藥材色譜對應處，可見黃綠色熒光斑點；在與對照品色譜對應處，可見相同顏色的斑點；陰性無干擾，見圖2。

2.6 總鞣質含量測定[9-12]

2.6.1 溶液配制

2.6.1.1 磷鉬鎢酸試液的配制 取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)。冷卻，加水稀釋至1000 mL，濾過，即得。另外，磷鉬鎢酸試液不得顯綠色(如放置后變為綠色，可加溴0.2 mL，煮沸出去多余的溴，可恢復原色。)

2.6.1.2 29%碳酸鈉溶液的配制 稱取無水碳酸鈉29 g，溶于100 mL蒸餾水中，即得。(不溶解可水浴加熱并不斷攪拌至溶解，需現用現配。)

2.6.1.3 對照品溶液的配制 精密稱取沒食子酸對照品0.0504 g(純度90.8%)，置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得45.76 μg/mL對照品溶液。

2.6.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置50 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液2 mL，再分別加水23，22，20，18，16，14 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在760 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為：Y=100.65x+0.3108(r=0.9996)，沒食子酸在0.0229～0.2290 mg吸光度與濃度呈良好的線性關系。

2.6.3 供試品溶液的制備[13]取供試品1.00 g，精密稱定至100 mL棕色容量瓶，加水在80 ℃水浴中加熱2 h并時時振搖，放冷，置冰浴中冷卻1 h，迅速用濾膜(0.45 μm)濾過，精密量取5 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.4 總酚的測定 精密量取“2.6.3”項下供試品溶液4 mL，置50 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液2 mL，加水20 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min以不加供試品的試劑為空白依法測定吸光度，從“2.6.2”項下標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的濃度(μg/mL)，計算，即得。

2.6.5 不被吸附的多酚的測定 精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30 ℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液4 mL，置50 mL棕色量瓶中，后同“2.6.4”項下操作相同，測得沒食子酸的濃度(μg/mL)，計算，即得。

2.6.6 總鞣質的測定 總鞣質的含量=總酚量-不被吸收多酚量

2.6.7 專屬性考察 取供試品溶液按“2.6.4”和“2.6.5”項下方法制備樣品，在190～800 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果在760 nm有最大吸收，與對照品相同，表明其他成分對鞣質測定無干擾。

2.6.8 精密度考察 精密量取對照品溶液4 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加磷鉬鎢酸試液2 mL，加水20 mL，用29%碳酸鈉溶液定容，放置30 min，以相應試劑為空白，平行測定吸光度值5次，計算RSD為0.06%，表明該方法精密度良好。

2.6.9 穩定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h測定總鞣質的含量，結果總鞣質的平均含量為24.85 mg/g，計算RSD為1.96%，表明所制備的供試品溶液在12 h內測定穩定性較好。

2.6.10 重復性考察 取同一批次樣品6份，按“2.6.4”和“2.6.5”項下總酚和不被吸收多酚的方法制備，測定總鞣質的含量，結果總鞣質的平均含量為25.63 mg/g，計算RSD為1.99%，表明該方法重復性良好。

2.6.11 加樣回收率試驗 精密稱取同批已知總鞣質含量的軟膏樣品6份，每份0.50 g，分別精密加入沒食子酸對照品12.80 mg，按供試品溶液的方法制備，測定總鞣質的含量，結果見表4。結果表明，平均回收率為93.45%，RSD為2.69%，因此該方法樣品處理方法可行。

表4 加樣回收率試驗結果

2.6.12 樣品的含量測定 取“2.3”項下的制備3個不同批次軟膏，精確稱取1.00 g，每批次各3份，按“2.6.4”和“2.6.5”項下總酚和不被吸收多酚的方法制備，測定總鞣質的含量，結果見表5。3個批次軟膏的含量為24.34～27.10 mg/g，RSD為0.64～2.23%。

表5 樣品含量測定結果

3 討論

研究制備軟管為O/W型，硬脂酸與三乙醇胺作用生成的硬脂酸三乙醇胺一價皂，為陰離子型乳化劑，所制得的軟膏pH約為8左右，刺激性較鉀皂、鈉皂小，成品較細膩有光澤但化學穩定性較差。根據文獻資料[14]，藥物的量及成分性質影響藥物的穩定性，主要有兩個影響過程：第一，隨時間而分層，大部分主藥可能會遷移到與其極性相似的相體系中，造成主藥在軟膏中分布不均勻；第二，粒度的增加，制備過程中強剪切力形成的多相微粒體系隨時間增加而喪失表面能，逐漸合并聚集成大顆粒。研究表明[15]，乳狀液的液滴大小明顯隨乳化溫度而改變，所以乳化溫度宜控制在70～90 ℃較為合適。在預試驗過程中發現，乳化時間對軟膏的乳化影響較為明顯。因此選用藥物與基質比例、乳化時間和乳化溫度三個因素優化軟膏制備工藝，解決該軟膏穩定性差的問題，得到優化制備工藝參數。

軟膏制備工藝時，藥物為40%乙醇洗脫部位，在水中溶解性較差，因此加入少量乙醇(可對皮膚可產生刺激性，只能加少量)超聲溶解后與水相攪拌混合均勻，使藥物混懸在水相中。羥苯乙酯在軟膏中的防腐劑。因用量小，直接加固體粉末不易均勻，用醇溶液使分散均勻。鞣質是一類復雜的具有沉淀蛋白質性質的水溶性多元酚類化合物，見光易分解，故本實驗鞣質的含量測定過程中應避光操作且使用棕色瓶存儲溶液。在總鞣質的測定中，軟膏基質有一定影響，采用冰浴冷卻，快速過濾膜的方法去除基質干擾。

綜上，該軟膏的制備是為了滿足臨床需要對原有醫院制劑進行劑型開發，采用分離試驗和高溫試驗評估軟膏的成型工藝，確保軟膏質量穩定同時建立軟膏質量標準，為該制劑的二次開發打下基礎。后期將按照《中國藥典》2015版軟膏項下檢查指標開展微生物檢查等相關檢查試驗，加快開發進度。