苗藥理氣活血滴丸對大鼠慢性心力衰竭的保護作用

長福*

1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴陽中醫學院藥學院，貴州 貴陽 550025

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure,CHF)是器質性心臟病的最終結局，是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。細胞凋亡是一個受基因調控的程序性細胞死亡過程，心肌細胞凋亡發生于多種心血管疾病，與心律失常和心臟功能障礙密切相關，在心力衰竭發生進程中起著關鍵性的作用[2-3]。

現代中醫根據慢性心力衰竭的臨床表現，將其歸屬于“心悸”“心痹”“心水”“心衰”“胸痹”等疾病范疇，氣滯血瘀是慢性心力衰竭的常見證型[4-5]。理氣活血滴丸，是根據貴州苗族民間驗方結合傳統中醫藥理論研制而成的一種中藥復方制劑，其成分包括苗藥米槁(又名大果木姜子)、薤白、川芎、冰片，具有溫陽寬胸，理氣活血功效，對心悸、胸悶、胸痛、氣短、形寒等療效顯著，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛等[6]。近年來本課題組發現理氣活血滴丸對再灌注損傷心肌組織具有保護作用[7-8]，本研究從左心室功能和心肌細胞凋亡方面探討理氣活血滴丸對大鼠CHF的保護作用，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠60只，體重(180±20)g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(湘)2014-0010。

1.2 藥物和試劑 理氣活血滴丸，由貴州益佰制藥股份有限公司提供，批號：20161002；馬來酸依那普利片購自揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，批號：20160806；鹽酸異丙腎上腺素購自北京索萊寶科技有限公司，批號：I8480；大鼠腦鈉尿肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)試劑盒購自上海鑫樂生物科技有限公司，批號：xl-Er0038；TUNEL染色試劑盒(In situ cell death detection kit-POD法)購自瑞士羅氏公司，批號：10279600。

1.3 儀器 HX-101E小動物呼吸機和BL-420S生物信號采集與分析系統，成都泰盟軟件有限公司；RM2016轉輪式切片機，德國徠卡(Leica)儀器有限公司；Thermo全功能酶標儀，美國ThermoFisher儀器有限公司；BA200Digital數碼三目攝像顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司。

2 方法

2.1 大鼠慢性心力衰竭模型建立及分組 雄性SD大鼠(60只)，適應性喂養1周，隨機分為2組：對照組(10只)和CHF模型組(50只)。CHF模型組大鼠皮下注射ISO 170 mg/kg/d，連續注射2 d，每天1次，間隔時間為24 h，對照組注射等量的生理鹽水，持續誘導4周[9-10]。之后測定血清BNP含量，模型組大鼠血清中BNP濃度與正常組相比顯著升高，說明造模成功。CHF模型大鼠隨機分為5組：模型組，依那普利組(10 mg/kg/d)，理氣活血滴丸低劑量(43.75 mg/kg/d)、中劑量(87.50 mg/kg/d)、高劑量175.00 mg/kg/d)組，各組大鼠按相應劑量每天灌喂給藥1次，連續給藥4周。對照組和模型組大鼠灌胃等容積生理鹽水。

2.2 血清BNP含量測定 采集大鼠腹主動脈血液，4 ℃，2500 r/min離心10 min，取血清，之后按照試劑盒說明書步驟測定血清中BNP的含量。

2.3 左心室功能監測 大鼠稱重，腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，仰臥位固定于實驗臺上。做氣管插管，連接小動物呼吸機。分離右側頸總動脈，結扎分離的頸總動脈遠心端，動脈夾夾閉近心端。在動脈壁剪一小口，逆行刺入帶肝素的靜脈穿刺套管針，慢慢退出穿刺針，緩慢推進導管至左心室。穿刺套管與壓力換能器連接，接入BL-420S生物信號采集與分析系統，記錄左心室內壓峰值(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

2.4 TUNEL-POD染色法分析大鼠心肌細胞凋亡情況 切取左心室冠狀面中部心肌組織塊，4%多聚甲醛固定；固定后常規石蠟包埋，切片，常規脫蠟，37 ℃胰蛋白酶K處理25 min，PBS漂洗3次；切片滴加TUNEL反應混合液于暗盒中37 ℃處理1 h，PBS漂洗3次；滴加converter-POD液(連接辣根過氧化酶的熒光素抗體)，于暗盒中37 ℃處理30 min，PBS漂洗3次；DAB顯色，再蘇木素輕度復染。然后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。凋亡細胞核顏色為淺黃色或棕黃色，陰性表達為藍色，底色為白色。根據采集的圖像統計凋亡細胞百分率(AI)：凋亡率=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

3 結果

3.1 理氣活血滴丸對CHF大鼠血清BNP含量的影響 結果如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠血清中BNP濃度顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，理氣活血滴丸低劑量組大鼠BNP濃度降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；理氣活血滴丸中、高劑量組及依那普利組大鼠BNP濃度顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

3.2 理氣活血滴丸對CHF大鼠左心室功能的影響 與對照組相比，模型組大鼠左心室收縮壓(LVSP)及左心室內壓最大變化速率(±dp/dtmax)顯著降低，左心室舒張末壓(LVEDP )極顯著升高，差異均具有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，理氣活血滴丸低劑量組與模型組相比大鼠LVSP、LVEDP、左心室內壓最大變化速率(±dp/dtmax)差異均無統計學意義(P>0.05)；理氣活血滴丸中、高劑量和依那普利組大鼠LVSP和±dp/dtmax顯著升高，LVEDP顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清BNP水平、左心室功能指標及心肌細胞凋亡率檢測

注：與對照組比較，*P<0.05;**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 理氣活血滴丸對CHF大鼠心肌細胞凋亡的影響 結果如圖1所示：對照組大鼠心肌細胞凋亡陽性染色很少；模型組大鼠心肌細胞凋亡陽性染色明顯增多；理氣活血滴丸低劑量組與模型組比較，大鼠心肌細胞凋亡陽性染色變化不明顯；理氣活血滴丸中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌細胞凋亡陽性染色明顯減少。經統計各組心肌細胞凋亡率發現，見表1：模型組大鼠與對照組比較心肌細胞凋亡率顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌細胞凋亡率減少，但差異無統計學意義(P>0.01)，理氣活血滴丸中、高劑量組和依那普利組大鼠心肌細胞凋亡率顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.01)。

4 討論

心力衰竭是許多發展中的心臟病的最后階段，是心臟病導致死亡的主要原因。在心力衰竭過程中，心肌細胞凋亡可降低心肌收縮力，從而促進心力衰竭[11-12]。本研究理氣活血滴丸對心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用及抑制心肌細胞凋亡作用。

臨床上，血流動力學指標可直接反映心室舒張功能。LVSP是以等容收縮期結束時的左心室收縮壓為基礎，增強心室收縮或增加外周阻力，將導致LVSP增加；而LVEDP則是以等容收縮期結束時的左心室舒張壓為基礎的[13]。±dp/dtmax能反映心室壁張力的變化率，顯示心肌纖維收縮和延長的最大速度[14]，所有這些都是常用的評價心肌收縮和舒張功能的特征[13]。BNP是一種重要的利鈉肽，是臨床心力衰竭的生物標志物。心力衰竭時血流動力學改變。由于血容量和心室壁張力的增加，心臟負荷聚集，因此，大部分儲存在心室肌中的合成的proBNP被釋放。Serine蛋白酶激活proBNP，產生活化的BNP。BNP的增加可反映左心室舒張末期壓力的增加。在心力衰竭過程中，血清中的BNP濃度隨著心力衰竭程度的增加而增加[15-16]。本研究表明理氣活血滴丸能使慢性心力衰竭大鼠左心室收縮壓( LVSP)、左心室內壓最大變化速率(±dp/dtmax)顯著升高，左心室舒張末壓(LVEDP)顯著降低和血清BNP水平顯著降低，說明理氣活血滴丸能明顯改善慢性心力衰竭大鼠左心室功能。

CHF的發生是一個極其復雜的過程，目前還沒有一個明確的發病機制[17]。但是研究表明，心肌細胞凋亡在心力衰竭形成過程中起著至關重要的作用[3]。本研究發現，理氣活血滴丸能顯著降低心肌細胞TUNEL染色的陽性率，提示理氣活血滴丸對ISO誘導慢性心力衰竭大鼠左心室功能的改善作用，與其抑制心肌細胞凋亡有關，進而使理氣活血滴丸對大鼠慢性心力衰竭發揮保護作用。以往研究表明細胞凋亡主要有兩種途徑：外源性或死亡受體途徑和內在或線粒體途徑[18-19]，下一步課題組將對此展開深入研究。

綜上所述，理氣活血滴丸對ISO誘導的慢性心力衰竭大鼠具有保護作用，該保護作用與其能顯著改善CHF大鼠左心室功能，抑制心肌細胞凋亡作用有關。