西黃丸含藥血清對大腸癌細胞干性標志物表達的影響※

孔婧妍 楊 帆

（天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617）

大腸癌作為一種生活中常見的癌癥，給人們帶來了非常嚴重的危害。在全球所有的癌癥之中，大腸癌發病率一直居高不下，我國更是大腸癌的高發地區，在所有惡性腫瘤病死率中位居第5[1]。因此尋找能夠防治大腸癌的有效藥物并闡明其作用機制已成為當前研究亟待解決的問題。中醫藥在防治腫瘤方面具有獨特的優勢，已成為抗腫瘤治療的重要組成部分。大腸癌屬本虛標實的虛實夾雜病證，多與虛、瘀、痰、毒有關。中醫治療講究辨證論治，針對有形實邪，化堅活血解毒法在癌癥的治療中顯得十分重要。因此在選擇活血解毒藥物時，更要突出一個軟堅散結的關鍵功能特點。西黃丸由牛黃、麝香、乳香（醋制）、沒藥（醋制）粉末加黃米飯以水泛丸而成，具有豁痰散結，解毒消癰之功。該方主要針對痰、瘀、毒邪，即針對大腸癌邪實的特點進行治療，藥簡力專，是治療癰疽疔毒、瘰疬、痰核、流注、癌腫之名方。在臨床抗腫瘤方面，特別是在腫瘤聯合用藥方面發揮了重要作用[2-3]。但西黃丸抗大腸癌的具體分子機制仍需進一步明確。本實驗擬通過檢測腫瘤干細胞標志物CD44+／EpCAMhigh的表達情況，從腫瘤干性細胞的角度認識西黃丸抗大腸癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar雄性大鼠（許可證號：SGXK(津)2014-0001）；西黃丸（天津中新藥業樂仁堂制藥廠生產）；人大腸癌LoVo細胞株來源于本實驗保存的細胞株；1640培養基購自北京邁晨科技有限公司；胎牛血清和雙抗購自Hyclone，0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)購自 Gibco；DMSO、β-巰基乙醇購自Sigma；PBS磷酸鹽緩沖液購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體FITC anti-mouse/human CD44（103021） 和抗體PE anti-human CD326 (EpCAM)（324205） 均購自Biolegend公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西黃丸含藥血清的制備 （1）動物飼養及分組。28只雄性Wistar大鼠置于天津中醫藥大學動物房飼養，自由飲水進食（水和飼料均由天津中醫藥大學動物房提供），每只鼠籠最多飼養4只大鼠，以給予充分空間，墊料每日更換一次，室溫17℃～24℃。普通飼養1周后，對大鼠進行稱重分組，分為生理鹽水對照組與西黃丸低、中、高劑量組，每組7只。 （2）給藥方式和劑量。將西黃丸分別配制成2.16 g（kg·d）、3.24 g（kg·d）、4.32 g（kg·d） 濃度的懸濁液給予中藥組大鼠灌胃，生理鹽水組予生理鹽水4 mL，2次/d，連續7 d；于末次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃后1 h，采用股動脈取血法，全血采集到無菌離心管內。（3）血清制備。全血于4℃靜置，2 h；離心3 000 r/min，15 min，分離上清液；56℃水浴鍋滅活，30 min；0.22 M微孔濾器過濾除菌，分裝于1.5 mL無菌離心管中，每管1 mL，標記清楚后于-80℃冰箱保存備用。使用時用1640培養基稀釋至濃度為10%使用。

1.2.2 大腸癌LoVo細胞的培養與分組 取凍存的大腸癌LoVo細胞株，于37℃水浴箱迅速融化；用含10%FBS的1640培養液稀釋；離心1 000 r/min，5 min；棄掉廢液，加入適量新鮮完全培養基，接種到新的培養瓶中；置37℃、5%CO2細胞培養箱培養。次日進行換液，細胞到對數生長期時傳代。傳2～3代后，分為空白對照組、西黃丸低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別加入相應含濃度10%鼠血清的培養基；置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養。藥物作用48 h后處理細胞。

1.2.3 流式細胞分析術檢測CD44／EpCAM陽性率 去培養基，用PBS清洗細胞，0.25%的胰蛋白酶消化處理貼壁細胞，1640培養基終止消化。細胞重懸，將細胞懸液離心后棄上清液，用冰PBS重懸，調整細胞濃度為3.3×106個/mL。取流式上樣管分別加入上述細胞懸液，分別加入FITC標記的CD44抗體和PE標記的EpCAM抗體，混勻后，避光染色30 min。PBS洗滌去除未結合抗體成分后，用流式細胞儀進行檢測分析。重復以上試驗3次，統計均數和標準差。

1.3 統計學方法 用SPSS 17.0軟件。計量資料以均數標準差（x±s）描述。先對數據進行正態性檢驗，多組間比較單因素方差分析（one-way，ANOVA），方差齊的實驗結果采用LSD-t檢驗方法進行各組間的比較；方差不齊的實驗結果采用Dunnett-T3檢驗方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

西黃丸能夠降低大腸癌腫瘤細胞干性標志物CD44+／EpCAMhigh的表達百分比（圖1）。與空白對照組相比，LoVo細胞在西黃丸不同劑量的作用下，CD44+/Ep-CAMhigh表達的陽性率呈降低趨勢 (表1)。其中，中、高劑量組的差異有顯著的統計學意義 (P＜0.05)。提示西黃丸可能對大腸癌腫瘤干細胞活性存在抑制作用。

圖1 流式細胞術檢測CD44+／EpCAMhigh細胞百分比

表1 LoVo細胞中不同組別CD44／EpCAM的陽性率

3 討論

西黃丸（又名犀黃丸）載于 《外科證治全生集》，是中醫藥治療癌腫之名方，方中以牛黃為君，取其清熱瀉火，豁痰解毒之功；以麝香為臣，取其通諸竅之不利，開經絡之壅塞，活血通絡之功；乳香、沒藥具破癥結、散瘀血之效，共為佐藥，輔料黃米飯可調胃和中，以免諸藥攻邪太過而傷脾胃?，F代研究表明西黃丸對多種惡性腫瘤都有抑制作用[4-6]，已廣泛用于惡性腫瘤的治療，臨床療效明顯。

腫瘤干細胞是腫瘤細胞群體中的一部分特殊的腫瘤細胞亞群，具有自我更新、無限增殖、多向分化等潛能，在腫瘤的侵襲及轉移過程中發揮關鍵作用。研究發現EpCAMhigh/CD44+為大腸癌干細胞重要的表型特征。CD44分子作為一種細胞粘附分子，與多種惡性腫瘤的侵襲轉移有著密切的聯系[7-8]。EpCAM，又稱CD326，是由GA-733-2基因編碼的40 kd的糖蛋白，是最早被發現的腫瘤標志物之一[9]。EpCAM參與了信號傳遞、細胞遷移、增殖以及分化等過程，可在大腸癌組織中表達且有較高的檢測率，因此可作為臨床檢測大腸癌診斷的生物標志物。

本實驗選擇觀察大腸癌干細胞表面標記物CD44+/EpCAMhigh的表達情況，來推斷西黃丸對大腸癌腫瘤細胞干性的影響。通過流式細胞術，檢測西黃丸含藥血清作用于人體大腸癌LoVo細胞后，CD44+／EpCAMhigh作為檢測大腸癌腫瘤細胞干性指標，觀察西黃丸不同劑量組與空白對照組相比，CD44和EpCAM雙陽性的細胞數量占大腸癌LoVo細胞數量的比例變化。結果表明西黃丸中、高劑量組與空白對照組比較，CD44+/Ep－CAMhigh百分比有下降趨勢，且差異有統計學意義。提示西黃丸對LoVo細胞的腫瘤干細胞活性可能具有抑制作用，這可能是西黃丸防治大腸癌轉移的機制之一。運用現代生物技術手段探析西黃丸抗癌的作用機制，可以更好地發揮西黃丸的臨床價值，促進傳統中醫藥與現代生命科學技術相結合，為中醫藥的發展提供新的空間。