不同提取方式的五倍子對兩種臨床分離耐藥菌的體外抑制作用研究※

耿少輝 程 鳳 陳偉姣 李江波 王 帆 陳夢茹 楊麗萍 魏天貴 呂 越

（1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；4 河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，河南 鄭州 450046）

耐藥菌的大量產(chǎn)生增加了臨床患者死亡的危險性[1-2]，尋求能夠?qū)苟嘀啬退幘奶娲咕幬镆呀?jīng)成為全球關(guān)注的一個熱點。多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染的重要病原菌。近年來其感染在增多，且耐藥性日益嚴重[3-4]，已引起臨床和微生物學(xué)者的高度關(guān)注。有研究表明五倍子具有良好的抑菌效果[5]。但體外抑菌實驗大部分選用的是敏感標準菌株，有關(guān)五倍子對耐藥菌抑菌作用的研究相對較少，五倍子是否對臨床分離的多重耐藥菌具有抑菌作用，尚有待研究。五倍子抑菌成分復(fù)雜，各成分穩(wěn)定性差異較大[6]。目前常用的水煎煮、醇提取與超聲提取3種提取方法因提取溶劑與提取方式的不同，是否會使五倍子提取物的抑菌效果出現(xiàn)差異尚不明確。本實驗采用水煎煮、醇提取與超聲提取三種方法制備五倍子提取物，并與具有代表性的抗生素進行對比，系統(tǒng)研究了五倍子對多重耐藥鮑曼不動桿菌的抑制作用，期望能為臨床用藥劑型的選擇與進一步的實驗研究提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象 由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科提供的臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌。詳細耐藥情況見表1。

表1 臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌耐藥情況

1.2 實驗試劑 五倍子飲片300 g（批號：161101，購自南陽仲景百信醫(yī)藥科技有限公司）、無水乙醇5 L（批號：17-011-00015，購自滄州海岳化工有限公司）、牛肉蛋白胨250 g×1瓶（英國OXIOD公司）、瓊脂100 g×1瓶（鄭州安圖生物工程有限公司）、青霉素G藥敏紙片1瓶、慶大霉素藥敏紙片1瓶、磺胺甲惡唑藥敏紙片1瓶（天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 實驗儀器 電子天平1臺（OHAUS公司），恒溫水浴鍋和醫(yī)用超聲波清洗機1臺（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司）、一次性大號培養(yǎng)皿（直徑150 mm）30個（鄭州安圖生物工程有限公司）、生物安全柜1臺（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、接種環(huán)2個（萊博生物實驗耗材公司）、恒溫培養(yǎng)箱1個（天津市泰斯特儀器有限公司）、麥氏比濁儀1臺（法國梅里埃生物有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 五倍子提取物的制備 （1）水煎煮法。將五倍子飲片粉碎至過16目篩，稱取50 g，置燒杯中加水浸泡1～2 h，將燒杯放于電熱板，加入400 mL水煎煮30 min。趁熱用8層紗布過濾，濾渣另加300 mL水煎煮20 min。趁熱過濾，合并2次濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中80℃濃縮至50 mL，定容，置于高溫高壓滅菌鍋中滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。（2）醇提取法。水浴鍋溫度設(shè)置為80℃，稱取五倍子粉末20 g加入圓底燒瓶中。取200 mL 80%乙醇加入圓底燒瓶，浸泡1 h后，水浴加熱回流1 h，過濾。濾渣加入160 mL 80%乙醇，再次回流加熱1 h。過濾，合并2次濾液；置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中80℃濃縮，定容至20 mL。高溫高壓滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。（3） 超聲提取法。取25 g五倍子粉末，用250 mL 80%的乙醇浸泡30 min后放入超聲裝置中，50℃，100%功率超聲提取30 min。用八層紗布過濾取上清。殘渣加入250 mL 80%的乙醇，相同條件提取30 min。過濾。合并2次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80℃濃縮，定容至25 mL，高溫高壓滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。

1.4.2 培養(yǎng)基的制備 （1）液態(tài)培養(yǎng)基。稱取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解。使用1 mol/L NaOH與1 mol/L的HCl調(diào)試pH至7.6。在1.05 kg/cm2，121 ℃的條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min。將滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中保存24～48 h，觀察是否變渾濁，檢查滅菌是否徹底。（2）固態(tài)培養(yǎng)基。稱取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解。再加入25 g瓊脂糖，加熱溶化。使用1 mol/L NaOH與1 mol/L的HCl調(diào)試PH至7.6。相同條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min。待培養(yǎng)基溫度冷卻到50℃左右時，在超凈工作臺上將培養(yǎng)基均勻倒入無菌平板，厚度控制在4 mm。將滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中保存24～48 h，觀察是否變渾濁，檢查滅菌是否徹底。

1.4.3 菌株復(fù)蘇 將檢測后的細菌在固態(tài)培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落用生理鹽水配置成0.5麥氏濁度（相當于108 CFU/mL）菌液。

1.4.4 制作無菌小紙片 將打孔器制成的小紙片（直徑為5 mm） 放入培養(yǎng)皿中，高壓 (表壓：0.7 kg/cm2，溫度：115℃，時間：30 min)滅菌，取出放涼，即得實驗用的無菌小紙片。

1.4.5 體外抑菌實驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法進行體外抑菌實驗，使用接種環(huán)將0.5麥氏濁度菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上。實驗分為7組，即水煎組、醇提組、超聲提取組、青霉素組、慶大霉素組、磺胺甲惡唑組與陰性對照組，每組均設(shè)置6個無菌小紙片，均勻放置于培養(yǎng)基上。用校準過的加樣槍加1 g/mL中藥水煎劑溶液10 μL于無菌小紙片，其余各組以同樣的方法分別加入等量的醇提取劑與超聲提取劑。將培養(yǎng)皿于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，使用游標卡尺測量各抑菌環(huán)直徑。

1.4.6 觀測指標 抑菌環(huán)直徑：用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的判斷依據(jù)參照國內(nèi)同類型的實驗的標準作為結(jié)果：抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，＜10 mm為不敏感[8]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（x±s）表示，組間比較使用SPSS 21.0進行采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方式的五倍子對多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌抑制效果的比較 培養(yǎng)24 h后，3種提取方法的五倍子提取物對多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌強度為中度敏感。抑菌環(huán)直徑對比結(jié)果顯示，不同提取方式的五倍子對多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌抑制效果的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 3種五倍子提取物對兩種耐藥菌抑制效果的比較（x±s）

2.2 不同提取方式的五倍子與3種抗生素對兩種耐藥菌抑制效果的比較 對于多重耐藥鮑曼不動桿菌，五倍子提取物的抑菌環(huán)直徑均大于青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑的抑菌環(huán)直徑，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。對于多重耐藥金黃色葡萄球菌，五倍子提取物抑菌效果均優(yōu)于青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 五倍子提取物與3種抗生素對多重耐藥鮑曼不動桿菌的抑制效果比較 （x±s）

表4 五倍子提取物與3種抗生素對多重耐藥金黃色葡萄球菌抑制效果的比較 （x±s）

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種常用的提取方法提取的五倍子提取物對于多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，藥敏紙片法顯示抑菌效果呈中度以上敏感?；前芳讗哼蜃鳛榭咕帟r具有抗菌譜廣，抗菌作用強的特點，對葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果突出。青霉素G主要對革蘭氏陽性菌有效。慶大霉素是常用的氨基糖苷類抗生素，主要用于革蘭氏陰性菌引起的感染。本研究發(fā)現(xiàn)五倍子提取物對于多重耐藥菌的抑菌效果與青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑相比具有明顯優(yōu)勢。提示五倍子中含有可以抑制耐藥菌的有效成分，可為進一步從五倍子中篩選抗耐藥菌的有效抑菌成分提供依據(jù)。

本研究選用臨床與實驗室常用的3種提取方式：水煎煮、醇提取與超聲提取[9]。結(jié)果顯示：3種提取方式對于五倍子抑菌效果的影響差異不大，均可以提取出五倍子的有效抑菌成分。

制備過程中發(fā)現(xiàn)水煎煮提取濃縮后的藥液較為濃稠渾濁且不易過濾，而醇提取與超聲提取所獲得的藥液則較為清澈。出現(xiàn)這種差異的原因可能與溶劑的選取有關(guān)，用水提取會將淀粉、多糖等水溶性物質(zhì)混入到藥液中，導(dǎo)致藥液黏稠渾濁，而采用乙醇作為溶劑時可以有效濾除水溶性雜質(zhì)，提高藥液的純度。抑菌實驗顯示3種提取方式的提取物抑菌效果差異不大，如對藥液澄清度有一定要求可以選用乙醇作為溶劑進行提取。超聲提取具有時間短、操作簡便的特點，本研究證明了超聲提取可以使藥物中的有效成分在較低溫度下溶出，要求藥物提取溫度較低時可以選用該方法。

本研究結(jié)果顯示不同提取方式的五倍子對2種耐藥菌的抑菌效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與張莉等[10]的報道結(jié)果不一致：醇提取優(yōu)于水煎煮。原因可能有以下幾方面：（1）實驗菌株的選擇：本研究選用的為臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌與金黃色葡萄球菌，選取的臨床菌具有很強的耐藥性。以往的研究多為普通菌株或耐藥性較弱的敏感菌株，細菌的耐藥性弱，對抗菌藥物更加敏感。（2）制備工藝與流程：李學(xué)林等[11]證明不同的煎煮方法對中藥煎液的質(zhì)量影響較大。而水煎煮、醇提取與超聲提取3種常用的提取方法缺少統(tǒng)一的提取規(guī)范與質(zhì)量標準，每個研究所選擇的提取條件均存在差異，故提取條件的差異也會在一定程度上影響著藥物的抑菌效果。多項研究表明五倍子中含有鞣酸，沒食子酸等多種抑菌成分，對多種細菌均具有一定的抑制作用。本研究亦證明了五倍子對多重耐藥鮑曼不動桿菌的抑制作用。中藥由于成分復(fù)雜，作用靶點多，不易使細菌產(chǎn)生耐藥[12]。因此需進一步開展五倍子等具有抗菌作用的中藥的研究，并對五倍子的抑菌成分進行分離與檢測，研究五倍子對耐藥菌的作用機制，從而為臨床用藥與新型抗菌藥物的研發(fā)提供依據(jù)與方向。