HS-SPME-GC-MS分析玫瑰香葡萄中揮發(fā)性物質(zhì)的萃取條件優(yōu)化

岳 圓，劉 晶，張存智*

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物與制藥技術(shù)系，寧夏 銀川 750001；2.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，寧夏 銀川 750001）

葡萄酒是破碎或未破碎的新鮮葡萄果實(shí)或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵后獲得的飲料。香氣物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒質(zhì)量的主要因素之一，其主要來源有葡萄品種本身、生化反應(yīng)、微生物代謝、葡萄酒貯存期間的化學(xué)或酶反應(yīng)等[1-3]。葡萄酒中所含香氣成分的種類、含量、感官閾值是評判葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，決定了葡萄酒的風(fēng)味和典型性[4-5]。玫瑰香葡萄是鮮食和釀酒兼用品種，玫瑰香葡萄又名麝香葡萄，是原產(chǎn)英國的歐亞種葡萄[6]。玫瑰香作為鮮食、釀酒、制汁的兼用品種，在我國栽培面積較廣[7]，因其具有特殊的玫瑰香味深受消費(fèi)者喜愛。葡萄酒的揮發(fā)性物質(zhì)很大部分來自于葡萄果實(shí)[8]，所以研究葡萄果實(shí)香氣的意義十分深遠(yuǎn)。

葡萄果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)可以通過儀器提取出來，目前頂空固相微萃取法（head space solid phase microextraction，SPME）是普遍使用的技術(shù)手段之一，這種技術(shù)快速并且價(jià)格低廉，不需要使用溶劑，可以檢測出超低濃度的物質(zhì)，而且不需要太多的樣品量[9]。利用SPME技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜檢測，可以同時(shí)分析幾千種揮發(fā)性化合物，但在檢測過程中，檢測條件必須優(yōu)化[10]。在萃取過程中，萃取量、萃取頭類型、萃取溫度、萃取時(shí)間、加入的電解質(zhì)和pH值、試樣混合速率等都是影響萃取效果的重要因素[11-12]。有關(guān)玫瑰香葡萄果實(shí)香氣頂空固相微萃取條件的優(yōu)化鮮見相關(guān)報(bào)道，萃取過程中在平衡、吸附、解吸環(huán)節(jié)所用時(shí)間的長短研究也較少。

本研究采用不同的平衡時(shí)間、解吸時(shí)間、萃取溫度、吸附時(shí)間對玫瑰香果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行頂空固相微萃取（SPME），經(jīng)過氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）法檢測，通過比較不同萃取條件下玫瑰香果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的萃取差異，確定最適宜的萃取條件，為玫瑰香葡萄果實(shí)的檢測以及進(jìn)一步分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選自寧夏賀蘭山東麓玉泉營6年生玫瑰香葡萄。2016年達(dá)到商品成熟期時(shí)進(jìn)行采摘，采摘當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室預(yù)冷并貯藏于0℃冷庫中。實(shí)驗(yàn)所用試劑（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司。蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010型GC-MS聯(lián)用儀、HP-5色譜柱（30.0m×0.25mm，0.25 μm）：美國Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市子華儀器有限公司；頂空進(jìn)樣瓶20 mL：石家莊大晉科技有限公司；50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取頭（纖維頭）：美國Supelco公司；MOF-4086S低溫冰箱：日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將保存的樣品用液氮研磨至粉末狀，準(zhǔn)確稱取3 g放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，再量取5 mL飽和氯化鈉溶液，放入磁力轉(zhuǎn)子后，立即用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）/硅橡膠隔墊將樣品瓶密封壓緊[13]，將萃取頭插入萃取瓶，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，平衡一定時(shí)間并在萃取溫度條件下吸附一定時(shí)間，樣品萃取平衡后，選擇一定解吸時(shí)間進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.2 GC-MS操作條件

GC條件：毛細(xì)管色譜柱DB-1（30m×0.25mm×0.25μm），升溫程序：初始溫度40℃，保持3min，以5℃/min的速率上升至160℃，保持2min，再以8℃/min上升至220℃，保留5min，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度為200℃，掃描范圍：40～350 amu，采用選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM）模式條件下對樣品進(jìn)行分析，根據(jù)定性離子和保留時(shí)間對物質(zhì)進(jìn)行定性[14]。

1.3.3 SPME技術(shù)參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì)[15]

以平衡時(shí)間、解吸時(shí)間、萃取溫度及吸附時(shí)間為單因素設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。平衡時(shí)間設(shè)定為5 min、10 min、15 min，解吸時(shí)間設(shè)定為4min、5min、6min，萃取溫度設(shè)定為20℃、30℃、40℃，吸附時(shí)間設(shè)定為30 min、40 min、50 min，分別研究以上各因素對萃取結(jié)果的影響。

1.3.4 定性與定量分析

玫瑰香葡萄果實(shí)香氣成分分析采用GC-MS聯(lián)用儀[16]。數(shù)據(jù)分析運(yùn)用計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，確認(rèn)香氣物質(zhì)的化學(xué)成分，將相似性低于70%的物質(zhì)去掉，按峰面積歸一化法算出樣品各個(gè)組分的相對含量。揮發(fā)性物質(zhì)相對含量的計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 平衡時(shí)間的選擇

圖1 3種平衡時(shí)間條件下玫瑰香葡萄揮發(fā)性物質(zhì)萃取數(shù)量（A）和相對含量（B）的比較Fig.1 Comparison of the extraction number(A)and relative content(B)of volatile compounds from Muscat under three kinds of equilibrium time conditions

由圖1可知，當(dāng)平衡時(shí)間為5 min時(shí)，共鑒定出40種化合物，其中醇類11種，醛類4種，酸類2種，酯類3種，醚類3種，酮類2種，碳?xì)浠衔?3種，其他物質(zhì)2種，相對含量（分別占總揮發(fā)性物質(zhì)含量）分別為67.59%、1.95%、18.69%、3.52%、1.40%、1.69%、2.02%和0.25%。當(dāng)平衡時(shí)間為10 min時(shí)，共鑒定出39種化合物，其中醇類7種，醛類4種，酸類1種，酯類8種，醚類3種，酮類3種，碳?xì)浠衔?2種，其他物質(zhì)1種，相對含量分別為43.88%、1.07%、16.16%、18.39%、2.73%、2.07%、4.43%和6.68%。當(dāng)平衡時(shí)間為15 min時(shí)，共鑒定出41種化合物，其中醇類10種，醛類3種，酯類7種，醚類4種，酮類5種，碳?xì)浠衔?1種，其他物質(zhì)1種，相對含量分別為51.05%、1.12%、20.32%、13.78%、1.22%、0.83%、2.20%和1.93%。三種平衡時(shí)間下醇類化合物萃取的相對含量有顯著差異，平衡時(shí)間5 min時(shí)最高（67.59%），平衡時(shí)間10 min時(shí)最低（43.88%）。平衡時(shí)間15 min時(shí)醇類數(shù)量最低，其他兩組醇類物質(zhì)數(shù)量無明顯差異；各種處理方法萃取的碳?xì)浠衔锏臄?shù)量均較高，而相對含量均較低；各種處理方法萃取的酯類物質(zhì)種類和相對含量有顯著差異，平衡時(shí)間15 min條件下萃取的酯類物質(zhì)數(shù)量最多，其次是平衡時(shí)間10 min的結(jié)果，說明平衡時(shí)間越長，萃取的酯類物質(zhì)數(shù)量越多。而酯類相對含量則是平衡時(shí)間10 min時(shí)最高。酸類物質(zhì)種類在平衡時(shí)間5min時(shí)較其他兩組高。不同平衡時(shí)間下萃取的醛類、醚類、酮類物質(zhì)、碳?xì)浠衔锵鄬繜o顯著性差異，但平衡時(shí)間10 min時(shí)，醛類、醚類、酮類物質(zhì)種類較其他兩組的多。為獲得較全面的物質(zhì)信息、主要呈香物質(zhì)的相對含量比，選用平衡時(shí)間10 min進(jìn)行萃取較為適宜。

2.2 解吸時(shí)間的選擇

圖2 3種解吸時(shí)間條件下玫瑰香葡萄揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量比較Fig.2 Comparison of the number of volatile compounds from Muscat under three desorption time conditions

由圖2可知，當(dāng)解吸時(shí)間為4 min時(shí)，共檢測出31種化合物，其中醇類5種，酸類1種，酯類7種，醚類2種，酮類3種，碳?xì)浠衔?種，其他物質(zhì)5種。當(dāng)解吸時(shí)間為5 min時(shí)，共檢測出36種化合物，其中醇類4種，醛類3種，酸類2種，酯類4種，醚類5種，酮類2種，碳?xì)浠衔?0種，其他物質(zhì)6種。當(dāng)解吸時(shí)間為6 min時(shí)，共檢測出26種化合物，其中醇類3種，醛類1種，酸類1種，酯類4種，醚類3種，酮類1種，碳?xì)浠衔?種，其他物質(zhì)4種。解吸時(shí)間為5 min時(shí)，醛類、酸類、醚類、酮類、碳?xì)浠衔锏臄?shù)量均較高，醇類物質(zhì)數(shù)量在解吸時(shí)間4 min時(shí)最多，6 min時(shí)最少，說明解吸時(shí)間越長，醇類數(shù)量就越少，而酯類物質(zhì)數(shù)量是在解吸時(shí)間6 min時(shí)最多。由表1可知，在不同解吸時(shí)間條件下，各揮發(fā)性物質(zhì)差異顯著，其中芳樟醇、橙花醚、玫瑰醚、香葉醇等均在不同處理方法中被檢測出來，解吸時(shí)間5 min時(shí)峰面積顯著大于其他兩組。辛酸乙酯在解吸時(shí)間5 min時(shí)峰面積顯著大于解吸時(shí)間6 min時(shí)，而在解吸時(shí)間4 min時(shí)并未檢測到。橙花醇的峰面積在解吸時(shí)間5 min時(shí)顯著大于解吸時(shí)間4 min時(shí)，解吸時(shí)間6 min時(shí)并未檢測到。解吸時(shí)間5 min時(shí)，檢測到葵醛、檸檬醛、環(huán)丙烯、縮水甘油、丙二烯、巴豆酸乙烯酯，而在其他處理方法中并未檢測到。考慮到檢測出來的揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量以及峰面積的大小，選擇解吸時(shí)間5 min萃取較好。

表1 3種解吸時(shí)間條件下玫瑰香葡萄主要揮發(fā)性物質(zhì)峰面積比較Table 1 Comparison of peak area of main volatile compounds from Muscat under three desorption time conditions

2.3 萃取溫度的選擇

圖3 不同萃取溫度條件下玫瑰香葡萄揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量以及峰面積比較Fig.3 Comparison of the number and peak area of volatile compounds from Muscat under different extraction temperature conditions

由圖3可知，萃取溫度為20℃時(shí)，共檢測出34種化合物，其中醇類6種，醛類3種，酸類1種，酯類4種，醚類4種，碳?xì)浠衔?0種，其他物質(zhì)6種；萃取溫度為30℃時(shí)，共檢測出44種化合物，其中醇類6種，醛類3種，酸類1種，酯類9種，醚類3種，酮類3種，碳?xì)浠衔?1種，其他物質(zhì)8種；萃取溫度為40℃時(shí)，共檢測出42種化合物，其中醇類2種，醛類3種，酸類1種，酯類18種，醚類2種，酮類2種，碳?xì)浠衔?種，其他物質(zhì)6種。萃取溫度為40℃時(shí)，酯類物質(zhì)數(shù)量明顯增加，但其他類化合物數(shù)量較低，萃取溫度為30℃時(shí)，除酯類物質(zhì)，其他各類揮發(fā)性物質(zhì)種類較多。在20℃、30℃和40℃三種萃取溫度下，各類揮發(fā)性物質(zhì)峰面積差異也較為明顯，萃取溫度40℃條件下醇類物質(zhì)峰面積顯著低于其他兩種處理方法，其他兩組無顯著差異；醛類、醚類、酮類物質(zhì)和碳?xì)漕惢衔锓迕娣e均較低。30℃處理中的酸類物質(zhì)峰面積顯著高于其他兩組處理方法，不同溫度下萃取的酯類物質(zhì)峰面積差異顯著，其中40℃時(shí)最大，20℃時(shí)最小。由以上可以得出，考慮到檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和主要揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度，選擇萃取溫度30℃較好。

2.4 吸附時(shí)間的選擇

圖4 不同吸附時(shí)間條件下玫瑰香葡萄揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量比較Fig.4 Comparison of the number of volatile compounds from Muscat under different adsorption time conditions

由圖4可知，不同吸附時(shí)間條件下，醛類、酮類和碳?xì)浠衔镌跀?shù)量上無明顯差異，酯類物質(zhì)有明顯差異，吸附40 min時(shí)數(shù)量最多，吸附30 min時(shí)數(shù)量最少。吸附50 min條件下萃取的醇類物質(zhì)數(shù)量較其他兩種處理方法的多，吸附30 min時(shí)醇類數(shù)量較少。酸類、醚類在吸附50 min時(shí)較其他兩種處理方法的少。由表2可以看出，玫瑰醚、橙花醚、葵醛、香葉醇、肉豆蔻酸異丙酯的峰面積有顯著差異（P＜0.05），吸附40 min條件下各物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度最高；芳樟醇、辛酸乙酯在吸附50 min條件下峰面積最大，酞酸二甲酯則在吸附30 min條件下峰面積最大。薄荷腦、香葉酸只在吸附時(shí)間30 min時(shí)被檢測到；壬酸、大根香葉烯、水楊酸-2-乙基己基酯只在吸附40 min條件下檢測出來，其他處理方法并未檢測到，柏木腦、左旋乙酸冰片酯只在吸附50 min時(shí)被檢測到。綜合以上因素，考慮到各物質(zhì)的種類數(shù)量和主要揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度，吸附40 min條件下各揮發(fā)性化合物數(shù)量均較高，且響應(yīng)強(qiáng)度較高，故選擇吸附40 min較為合適。

表2 3種吸附時(shí)間條件下玫瑰香葡萄主要揮發(fā)性物質(zhì)峰面積比較Table 2 Comparison of peak area of main volatile compounds from Muscat under three kinds of adsorption time conditions

2.5 最優(yōu)萃取條件下的香氣成分

在最佳萃取條件下，經(jīng)GC-MS分析，共檢出70種化合物，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對以及去除雜質(zhì)物質(zhì)5種，共鑒定出39種主要揮發(fā)性化合物，匹配度均＞70%，說明采用頂空固相微萃取方法能夠定性分析玫瑰香葡萄香氣的主要成分，結(jié)果見表3。由表3可知，39種化合物峰面積之和占總峰面積的96.54%，說明此種方法可快速、準(zhǔn)確地定量玫瑰香葡萄的主要香氣成分。

研究發(fā)現(xiàn)，萃取溫度過高，會造成萃取出來的酯類物質(zhì)含量偏高，而其他物質(zhì)含量偏低，可能是由于溫度較高，使得揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生氧化，如醇類、醛類、酮類等物質(zhì)被氧化而形成酯類物質(zhì)。萃取溫度過低，使得揮發(fā)性物質(zhì)不能很好地萃取出來，造成揮發(fā)性物質(zhì)含量偏低，數(shù)量偏少。在平衡和解吸的過程中，如果時(shí)間過長，則萃取出來的酯類物質(zhì)較多，而其他種類的揮發(fā)性物質(zhì)較少，可能是由于過長的時(shí)間使得一些揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)氧化形成酯類物質(zhì)；時(shí)間過短，則萃取出來的物質(zhì)種類較少，響應(yīng)強(qiáng)度也較低。在吸附的過程中，隨著相對分子質(zhì)量的增大，化學(xué)物質(zhì)的萃取平衡較難達(dá)到，延長吸附時(shí)間，有利于達(dá)到萃取平衡。相對分子質(zhì)量較小的揮發(fā)性物質(zhì)平衡容易達(dá)到，但吸附時(shí)間過長，因競爭吸附會造成小分子物質(zhì)的脫附[18]。

表3 玫瑰香葡萄香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 GC-MS analysis results of aroma compounds from Muscat

葡萄果實(shí)的風(fēng)味主要由成香（香氣物質(zhì)）和成味物質(zhì)決定（糖、酸）[19]。本研究檢測出玫瑰香葡萄中醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是主要的香氣物質(zhì)，其中芳樟醇的響應(yīng)強(qiáng)度最高，達(dá)到108；其次為香葉醇、酞酸二甲酯，響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到107；橙花醇、辛酸乙酯、葵酸乙酯、香葉醇、玫瑰醚等物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度為106，這些物質(zhì)中，橙花醇，有溫和的甜香氣味，辛酸乙酯，有玫瑰、橙子的花果香[13]，葵酸乙酯具有椰子香型香氣，香葉醇具有溫和、香甜的玫瑰花氣息，玫瑰醚，有清甜的花香香氣，似玫瑰和新鮮香葉的香韻，香氣偏甜細(xì)膩[20]，這些物質(zhì)均能表現(xiàn)出玫瑰香果實(shí)特有的香氣。劉波[21]等研究表明，利用GC-MS技術(shù)進(jìn)行分析，主要成分為3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇（沉香醇）和2-己烯醛，其相對含量分別為21.043%和10.400%，本研究與該報(bào)道有相似之處，也檢測出有沉香醇物質(zhì)，在最佳萃取條件下相對含量為22.11%，不同之處在于本研究檢測出芳樟醇、香葉酸為主要物質(zhì)，相對含量分別達(dá)到35.24%、18.67%。劉萬好等[22]研究表明，玫瑰香果實(shí)在萃取溫度為60℃時(shí)吸附45 min，可萃取24種揮發(fā)性化合物，能檢出玫瑰香葡萄中含有里那醇、2-己烯醛、β-月桂烯、蒎烯、紫蘇烯、苯乙醇、異戊醇等物質(zhì)，而本研究并未檢測到，可能是由于玫瑰香葡萄的產(chǎn)地不同，因而香氣成分略有差異。但本研究萃取的化合物數(shù)量較多，萃取條件更優(yōu)。

3 結(jié)論

本研究比較了平衡時(shí)間、解吸時(shí)間、萃取溫度、吸附時(shí)間四個(gè)因素對玫瑰香葡萄檢出的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和各類揮發(fā)物的峰面積的影響，最優(yōu)組合為平衡時(shí)間10 min，解吸時(shí)間5 min，萃取溫度為30℃，吸附時(shí)間40 min。在此優(yōu)化萃取條件下，得到的揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度較高，檢測出玫瑰香果實(shí)的主要揮發(fā)性物質(zhì)有芳樟醇、橙花醚、玫瑰醚、橙花醇、香葉醇、辛酸乙酯、檸檬醛、酞酸二甲酯、棕櫚酸甲酯、正辛基醚等。本研究建立的GC-MS分析方法可以獲得較全面的玫瑰香葡萄中揮發(fā)性物質(zhì)的組成信息。