生物傳感器法檢測葡萄汁中葡萄糖含量

畢春元，杜 祎，張金玲，高廣恒，史建國*

（齊魯工業大學（山東省科學院）山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250014）

葡萄酒是目前被全球普遍接受的一種酒精飲料，因保健作用及豐富的文化內涵越來越受到國人的喜愛。葡萄糖含量是影響葡萄酒質量和區分葡萄酒種類的重要功能性指標之一。葡萄汁是釀造葡萄酒的原料，其所含糖類主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖[1-8]，因此建立一種能夠快速準確專一性檢測葡萄糖含量的方法對高品質葡萄酒的釀造具有重要的意義。

目前，測定葡萄汁中葡萄糖含量的方法主要是糖度計法、二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法、高效液相色譜法和酶法。糖度計法只能測定總糖含量；DNS法耗時長、操作繁瑣且只能測定總還原糖含量；高效液相色譜法儀器昂貴，所需試劑多，測定費時，成本高[9-15]。

本研究采用葡萄糖測定的酶-電極法，首先在生物傳感分析儀雙電極系統內以1‰葡萄糖溶液為標準品檢測該方法的線性、穩定性、抗干擾性和專一性，最后通過對赤霞珠和巨峰兩個不同品種的葡萄汁中葡萄糖含量進行檢測，建立了葡萄汁中葡萄糖含量的酶電極測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄，巨峰葡萄：均購自濟南七里堡市場；葡萄糖氧化酶（10 U/mL）：Sigma公司；牛血清白蛋白、戊二醛：上?；瘜W試劑采購供應站進口分裝；“O”型圈、SBA生物傳感分析儀專用稀釋水、緩沖液：山東省科學院生物研究所自行配制；聚碳酸酯膜、核微孔膜（孔徑0.2 mm）：美國Nucleopore公司；鉑、銀純度為99.999%：中國人民銀行濟南分行。其他試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

SBA-40D型生物傳感分析儀、葡萄糖氧化酶-酶電極、50 μL微量進樣器：山東省科學院生物研究所；MZB-45糖度計、DHG-9038A烘干箱：上海米青科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

將葡萄糖氧化酶與過氧化氫電極（電流型電化學電極）自組裝成酶電極，結構示意圖如圖1所示。

當樣品與酶電極接觸后，會在電極上發生如下反應：

圖1 葡萄糖氧化酶酶膜與過氧化氫電極結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of glucose oxidase membrane and hydrogen peroxide electrode

此電流大小與葡萄糖的濃度呈現線性關系，該過程的實現如圖2所示。通過數模轉換器將電流大小轉化成可以直接讀取的數字信號，即可方便準確快捷的測定葡萄糖含量。

圖2 SBA-40D型生物傳感分析儀系統示意圖Fig.2 Schematic diagram of instrument system SBA-40D biosensor analyzer

1.3.2 葡萄糖氧化酶酶膜及酶電極的制備

選取聚碳酸酯膜為固定化載體，首先將“O”型空圈與核微孔膜粘在一起做成載體膜，用蒸餾水沖洗后于60℃烘箱烘40 min，取出備用。

然后將1mL葡萄糖氧化酶與1 mL3%牛血清白蛋白用3.5%戊二醛交聯，固定化于已經制備好的載體膜上，用蒸餾水沖洗后20℃烘干箱烘10 min，取出，獲得葡萄糖氧化酶酶膜，放于4℃冰箱保存，備用。

將過氧化氫電極表面用蒸餾水清洗，然后用吸水紙擦干，再用電極擦進行進一步清潔。在電極表面滴一滴SBA專用緩沖液，將制備好的葡萄糖氧化酶酶膜固定化有葡萄糖氧化酶的一側貼于電極表面，不能有氣泡，獲得葡萄糖氧化酶電極。

1.3.3 葡萄糖標準液的配制

取適量葡萄糖標準品放入稱量瓶中，于104℃烘干箱內烘4 h，然后在干燥器內冷卻；準確稱取0.100 0 mg葡萄糖標準品，用蒸餾水在100 mL燒杯中溶解，并全部轉移至1 000 mL容量瓶，定容備用。

1.3.4 葡萄汁待測樣品溶液的配制

取待測葡萄樣品適量，洗凈，晾干，打碎，過濾。準確吸取1mL濾液滴入250 mL具塞錐形瓶中，加入99 mL蒸餾水，混勻，擰緊瓶塞，備用。

1.3.5 樣品的測定

選用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH7.2），在SBA-40D儀器上安裝葡萄糖酶電極，接通電源，系統自動清洗反應池，當儀器提示定標時，用微量進樣器準確吸取25 μL按照1.3.3所配制標準液注入儀器反應池內，儀器自動分析，當儀器再次提示定標時，用同樣的方法再次注入標準液，直至儀器提示定標通過。然后取1.3.4所配制待測液注入儀器反應池內進行測定，打印測定結果。

1.3.6 生物傳感器法測定葡萄糖的線性

參照1.3.3的方法分別準確配制質量濃度為200 mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的葡萄糖標準液，參照1.3.5的方法對每一個濃度梯度標準液進行3次平行測定，打印測定結果，計算生物傳感器法測定葡萄糖的線性。

1.3.7 生物傳感器法測定葡萄糖的穩定性

參照1.3.5的方法，當儀器定標通過后，連續測定10次，生物傳感器法測定葡萄糖的穩定性。

1.3.8 生物傳感器法測定葡萄糖的加標回收率

參照1.3.4的方法配制5份葡萄汁樣品待測溶液A、B、C、D、E，從5個樣品待測液中準確吸取1 mL分別放入5 mL試管內，然后依次添加1 mL 100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400mg/L、500mg/L葡萄糖標準液，標號A1、B1、C1、D1、E1；從A、B、C、D、E 5個樣品待測液中準確吸取1 mL分別放入5 mL試管內，分別加入1 mL蒸餾水，混勻，標號A2、B2、C2、D2、E2；測定10只試管內葡萄糖含量，計算生物傳感器法測定葡萄糖的加標回收率。

1.3.9 生物傳感器法測定葡萄糖的專一性檢測

參照1.3.3的方法分別配制質量濃度為1g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、纖維素、淀粉、蔗糖標準液，用1.3.5的方法進行檢測，檢測生物傳感器法測定葡萄糖的專一性。

1.3.10 不同方法測定葡萄汁中葡萄糖含量的對比

分別取赤霞珠、巨峰兩個品種，參照1.3.4的方法制得待測液。采用生物傳感器法、糖度計法和DNS法分別對同一種樣品進行測定，對測定結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 生物傳感器法測定葡萄糖的線性檢測

參照1.3.3的方法分別準確配制質量濃度為200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的葡萄糖標準溶液，參照1.3.5的方法對每一個濃度梯度標準液進行3次平行測定，葡萄糖測定的線性關系結果如圖3所示。

圖3 生物傳感器法測定葡萄糖含量的線性關系Fig.3 Linear relationship of glucose content by biosensor measurement

由圖3可見，在葡萄糖質量濃度0～1 000 mg/L的范圍內生物傳感器測定葡萄糖含量的方法具有很好的線性關系，線性回歸方程為y=0.994 8x-3.081，相關系數R2=0.999 9。

2.2 生物傳感器法測定葡萄糖的穩定性檢測

參照1.3.5的方法，當儀器定標通過后，連續測定10次，測定結果如表1所示。

表1 生物傳感器法測定葡萄糖含量的穩定性結果Table 1 Determination results of the stability of glucose content by biosensor

由表1可見，生物傳感器測定葡萄糖含量的方法，測定結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.63%，表明該方法穩定性良好。

2.3 生物傳感器法測定葡萄糖的加標回收率

對10只試管內葡萄糖含量進行測定，結果如表2所示。

表2 生物傳感器法測定葡萄糖含量的加標回收率Table 2 Adding standard recovery rate of glucose content determination by biosensor

由表2可見，生物傳感器法測定葡萄汁中葡萄糖含量的加標回收率為96.0%～102.4%，表明該方法準確性良好。

2.4 生物傳感器法測定葡萄糖的專一性檢測

參照1.3.3的方法分別配制質量濃度為1 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、纖維素、淀粉、蔗糖標準液，用1.3.5的方法進行檢測，測定結果如表3所示。

表3 生物傳感器法測定葡萄糖的專一性測定結果Table 3 Determination results of specificity of glucose by biosensor

由表3可見，除葡萄糖外，其他糖類基本無法測出，因此生物傳感器測定葡萄糖含量的方法具有很好的專一性。

2.5 不同方法測定葡萄汁中葡萄糖含量的對比

分別取赤霞珠、巨峰兩個品種，參照1.3.4的方法制得待測液。采用生物傳感器法、糖度計法和DNS法分別對同一種樣品進行測定（n=3），對測定結果進行比較，結果見表4。

表4 生物傳感器法、糖度計法和DNS法對葡萄糖含量測定結果的比較Table 4 Comparison of glucose content determination by biosensor,brix and DNS method%

由表4可以看出，生物傳感器法測定巨峰和赤霞珠兩種葡萄中葡萄糖含量的結果明顯低于糖度計法和DNS法，因為糖度計法和DNS測定的是總糖和總還原糖的含量，而生物傳感器法是對葡萄糖專一性測定。

3 結論

本研究建立了生物傳感器法檢測葡萄汁中葡萄糖含量的方法。在葡萄糖質量濃度為0～1 000 mg/L的范圍內生物傳感器法測定葡萄糖含量的線性良好；線性回歸方程為y=0.994 8x-3.081，相關系數R2=0.999 9；穩定性好，相對標準偏差（RSD）=1.63%；加標回收率為96.0%～102.4%。通過對DNS法和糖度計法測定葡萄汁中葡萄糖含量結果進行比較，表明該方法測定葡萄汁中葡萄糖含量具有專一性好、準確度高、分析速度快、樣品處理簡單等特點，是葡萄汁中葡萄糖含量測定的理想方法，對葡萄汁加工過程和產品質量控制具有一定的應用價值。