迷迭香酸在沙棘果酒中的應用研究

王 瑩，劉鳳霞*，王文慶，蘇舉一，薛 剛，皮 倩

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；3.河南佳尚農業科技發展有限公司，河南 魯山 467300）

沙棘果中富含沙棘黃酮、維生素C（vitamin C，VC）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等有保健作用的活性物質，具有抗衰老、抗氧化等作用[1-4]。沙棘果漿經發酵后制成的沙棘果酒營養成分豐富[5-6]，在發酵果酒時常添加60 mg/L的二氧化硫進行發酵。二氧化硫主要是抑菌、抗氧化，二氧化硫影響酒的質量，能與果酒中的色素結合，生成無色的加成產物對酒具有漂白作用，SO2可抑制蘋果酸-乳酸發酵，許多果酒都要進行該反應，但酒中游離SO2對乳酸菌有強烈的抑制作用，而二氧化硫對該過程的抑制與游離二氧化硫濃度有關，當其濃度較低時，抑制作用較小，濃度高時，這一過程明顯推遲，當濃度更高時，這一過程直接不能進行[7]。牛廣財等[8]對沙棘果酒主發酵工藝的研究發現，沙棘中二氧化硫的最適添加量為80～120 mg/L。由于二氧化硫對人的健康存在一定的影響，需要研究新型的抗氧化劑添加到果酒發酵中。文獻報道[9]在果酒中添加的新型抗氧化劑有乙二胺四乙酸二鈉、植酸、茶多酚、竹葉黃酮等。迷迭香提取物中迷迭香酸的抗氧化作用最明顯，而且與其他抗氧化劑相比，具有安全、穩定等優點，因此推薦其在食品中使用[10]。

本實驗以沙棘果漿為原料，以不添加、添加抗氧化劑迷迭香酸或二氧化硫進行果酒發酵，并對果酒進行抗氧化性測定和澄清實驗，為沙棘果酒發酵添加迷迭香酸取代二氧化硫作為抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母：購自安琪酵母股份有限公司。沙棘果漿：北京匯源布爾津沙棘產業有限公司（新疆分公司）。8%迷迭香酸：河南佳尚農業科技發展有限公司。白砂糖、食用明膠均為市售食品級；果膠酶（5萬U/g）：和氏壁生物技術有限公司。

二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、甲基紅、亞甲基藍等（均為分析純）：國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

三聯體低溫發酵罐：實驗室自制；1260型高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；LXJ-IIB低速離心機：上海安亭科學儀器廠；752N型紫外可見分光光度計：上海電分析儀器有限公司；HFM-0530中空纖維膜過濾設備（過濾孔徑或截留分子量為100 kDa）：廈門福美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果酒生產操作要點

（1）沙棘原漿的離心：稱取7.0 g明膠加入14 L果漿中，放入40℃烘箱中1 h，取出4 500 r/min離心10 min。

（2）發酵進程的工藝控制：其中一個罐中不加抗氧化劑，另外兩個罐分別添加二氧化硫或迷迭香酸作為抗氧化劑。每罐白砂糖添加量為220 g/L，酵母添加量為0.2 g/L。

（3）控溫發酵：主發酵溫度控制為20℃，低溫發酵溫度控制為18℃。

（4）離心、過濾：發酵結束后4500r/min處理15min，得到清液后用截留100kDa分子質量的中空纖維超濾膜進行過濾。

1.3.2 果酒理化指標測定

（1）酒精度、總糖、還原糖、揮發酸、總二氧化硫和游離二氧化硫含量：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進行。可溶性固形物含量：用手持糖量計測定；密度：用密度計測定。

（2）迷迭香酸含量測定：采用高效液相色譜儀測定，色譜條件為C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60，V/V）為流動相，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，于波長330 nm處進行檢測。

1.3.3 果酒抗氧化活性測定

按照文獻[12-13]，分別采用DPPH法、普魯士藍法和水楊酸法測定沙棘果酒清除DPPH自由基能力、還原力和清除羥自由基的能力。

2 結果與分析

2.1 沙棘發酵過程中的理化指標變化

經離心的沙棘原漿分成3份，每份為3 L沙棘原漿加4 L水（調總酸（以酒石酸計）至6.0～6.5 g/L），加入220 g/L的白砂糖，0.2 g/L的酵母營養劑，其中兩份分別加入750 mg/L的8%迷迭香酸粗品（相當于60 mg/L迷迭香酸）、120 mg/L的偏重亞硫酸鉀（相當于60 mg/L二氧化硫），另一份不添加抗氧化劑。混合均勻后進行發酵。沙棘發酵過程中的理化指標變化見表1。

表1 沙棘果酒發酵過程中理化指標檢測Table 1 Index detection in the fermentation process of sea buckthorn fruit wine

由表1可知，發酵至第10天時，3個發酵罐中，可溶性固形物由23 g/L降至8 g/L，密度由1.08 g/L降至0.99 g/L；加入迷迭香酸與不加抗氧化劑的發酵罐中還原糖、總糖含量均＜5 g/L。而加入二氧化硫的發酵罐中，發酵5 d時還有11.88g/L還原糖，說明二氧化硫對酵母發酵有一定的影響。

根據國標要求酒精度為12%vol～24%vol，揮發酸≤1.1 g/L，游離二氧化硫≤20 mg/L，總二氧化硫≤250 mg/L，所以3種方式發酵得到的沙棘果酒均在國標允許范圍內。因此在沙棘果酒發酵時，添加迷迭香酸作為抗氧化劑替代二氧化硫，不會影響果酒發酵。

2.2 產品的抗氧化活性測定結果

（1）DPPH法測定沙棘果酒抗氧化活性

不同果酒對DPPH·的抗氧化實驗結果見表2。由表2可知，各果酒濃度與DPPH·清除能力之間呈現較好的線性關系，對比不加抗氧化劑與加二氧化硫和迷迭香酸作為抗氧化劑的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值可以發現，加迷迭香酸的IC50值最小，為8.02mg/mL。說明迷迭香酸清除DPPH·能力較二氧化硫要好。

表2 不同濃度果酒對DPPH的抗氧化實驗結果Table 2 Effects of sea buckthorn fruit wine with different concentration on DPPH antioxidant capacity

（2）水楊酸法和普魯士藍法測定沙棘果酒抗氧化活性

分別取5個待測樣各2 mL，利用水楊酸法和普魯士藍法測定果酒中總抗氧化能力的大小，測定結果如表3。

表3 不同方式發酵沙棘果酒抗氧化性測定結果Table 3 Determination results of antioxidant of sea buckthorn fruit wine with different fermentation methods

由表3可知，清除·OH的能力大小順序為：迷迭香酸果酒（清除率99.31%）＞無添加抗氧化劑果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；還原力大小順序為：二氧化硫果酒＞迷迭香酸果酒＞無添加抗氧化劑果酒。未添加抗氧化劑的沙棘果酒具有一定的羥自由基清除能力，分析原因是沙棘果酒原料中自身存在抗氧化劑成分，如維生素C、黃酮、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等。添加迷迭香酸的沙棘果酒具有較好的羥自由基清除能力及總還原力，迷迭香酸可以作為抗氧化劑替代二氧化硫進行使用。

3 結論

結果表明在沙棘果酒發酵時，添加迷迭香酸作為抗氧化劑替代二氧化硫，不會影響果酒發酵。

3種方式發酵果酒清除DPPH·的能力大小順序為迷迭香酸果酒（IC50=8.02 mg/mL）＞二氧化硫果酒（IC50=10.31 mg/mL）＞無添加抗氧化劑果酒（IC50=11.47 mg/mL）；清除·OH能力大小順序為迷迭香酸果酒（清除率99.31%）＞無添加抗氧化劑果酒（清除率98.83%）＞二氧化硫果酒（清除率98.67%）；還原力大小順序為二氧化硫果酒>迷迭香酸果酒＞無添加抗氧化劑果酒。迷迭香酸可以替代二氧化硫作為抗氧化劑進行果酒釀造，從而避免二氧化硫對人類健康存在的影響。