胡柚果酒釀造工藝優化

曹敬華，丁建設，楊裕才，陳茂彬，朱正軍*

（1.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室 工業發酵湖北省協同創新中心 工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.鄂州市梁子湖綠色食品開發有限公司，湖北 鄂州 436061）

胡柚（Citrus paradisi）是柚子與其他柑橘或橙自然雜交后的產物，是柑桔屬植物的一個新品種[1]，富含多種維生素和人體所需的16種氨基酸以及磷、鉀、鐵、鈣等礦物質元素[2]。具有清涼祛火、鎮咳化痰、調節血糖、潤喉醒酒、養顏益壽等諸多藥理功效[3-4]，雖然胡柚具有較高營養和保健價值，但其苦味物質含量居柑橘類之首[5]。柚皮苷是導致柑橘類水果呈現苦味的主要成分之一[6]，它在柑橘類水果果汁中的閾值約為30 mg/L[7]，而胡柚果汁中柚皮苷含量在50 mg/L以上[8]，因此胡柚果汁的苦味特別強烈，這一特點限制了胡柚在食品工業中的廣泛應用。

胡柚果酒是將胡柚果肉榨汁后再經發酵制備而成，果肉中的柚皮苷也都進入最終的胡柚果酒中。因此，通過工藝手段降低柚皮苷含量即可減弱胡柚果酒的苦味，以獲得良好的口感和風味。在苦味消除研究方面，可采用吸附苦味的方法，通過大孔吸附樹脂、活性碳、硅膠的吸附作用進行脫苦[9]，也可采用柚苷酶（naringinase）酶解方法，通過添加柚苷酶水解柑橘類水果果汁中的柚皮苷，將柑橘類苦味成分分解成無味的野櫻素和柚配質，從而減弱苦味，提升產品質量[10-12]。

本研究以新鮮胡柚為原料，利用篩選得到的果酒專用酵母為發酵菌種，研制胡柚果酒。通過單因素及響應面試驗對發酵工藝參數進行優化，制備一種弱苦味的胡柚果酒，在獲得胡柚果酒良好飲用體驗的同時，為其工業化生產提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡柚：鄂州市梁子湖綠色食品開發有限公司；柚苷標品（純度99%）：美國Sigma公司；柚苷酶（酶活200000U/g）：上海陸安生物科技有限公司；酵母菌（耐乙醇）：實驗室選育；白砂糖：市售；檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實業有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；一縮二乙二醇（分析純）：天津市鴻發化工有限公司；其余化學試劑均為國產分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

721G分光光度計：上海精科儀電；ZHJH-C1214B超凈工作臺：上海智城分析儀器有限公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；AR1140電子分析天平：奧克斯國際貿易有限公司；PHX智能生化恒溫培養箱：寧波萊福科技有限公司；0.2分度酒精計：武強縣精創儀器儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 胡柚果酒加工工藝流程及操作要點

胡柚→去皮→破碎、打漿→調整成分→酵母活化、接種→前發酵→壓榨→后發酵→陳釀→澄清→過濾→滅菌→成品酒

操作要點：

去皮：選取新鮮胡柚，去除霉變和腐爛的果實，清洗去除雜質和異物，去皮。

破碎、打漿：將去皮胡柚放入螺旋壓榨機，胡柚果渣和果漿分離，保留果漿備用。

調整成分：添加白砂糖使果漿總糖達到220 g/L，按40 mg/L果漿的量添加SO2，再按40 mg/L果漿的量添加柚苷酶，混勻。

酵母活化、接種：接種1環酵母到10 mL YPD液體培養基中，25℃條件下培養20～24 h后，將其轉接到10倍體積的YPD液體培養基中，再于25℃條件下擴大培養18～24h。

前發酵：接種4%酵母菌進行發酵，發酵溫度20℃，發酵時間7 d，當總糖含量＜4 g/L時前發酵結束。

壓榨：發酵液經過壓濾機過濾得到胡柚果酒。

后發酵：將胡柚果酒用泵打入后酵罐。

陳釀：20℃貯存15 d。

澄清、過濾：經硅藻土過濾機和膜過濾機處理后，用泵打入暫存罐保存。

滅菌：65～70℃保溫10 min滅菌[13]，即得胡柚果酒。

1.3.2 發酵工藝優化單因素試驗

以酒精度和脫苦率為評價指標，分別考察柚苷酶添加量（40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L）、SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）、酵母接種量（4%、5%、6%、7%、8%）、發酵溫度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）對胡柚果酒品質的影響。

1.3.3 發酵工藝優化Box-Behnken響應面試驗

結合單因素試驗結果，選擇胡柚果酒SO2添加量40mg/L。運用響應面分析法，設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，考察發酵溫度（X1）、酵母接種量（X2）、柚苷酶添加量（X3）對胡柚果酒品質的影響。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 分析檢測

（1）柚皮苷含量測定

稱取10mg柚皮苷標品，在110℃干燥至恒質量，用無水乙醇溶解并定容至100mL，得到柚皮苷標準溶液（100mg/L）。分別吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL柚皮苷標準溶液，在堿性條件下（1 mol/L NaOH 0.5 mL）與體積分數為90%的一縮二乙二醇5 mL在30℃恒溫水浴保溫條件下進行顯色反應，在波長420 nm處測吸光度值，繪制柚皮苷標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算樣品中柚皮苷的含量，脫苦率計算公式如下：

式中：D為脫苦率，%；C0為處理前果汁中柚皮苷含量，mg/L；C1為處理后果汁中柚皮苷含量，mg/L。

（2）酒精度檢測

按國標GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[14]進行檢測。

1.3.5 數據處理方法

所有試驗數據均取3次重復試驗的平均值，利用Design-Expert 8.0.6統計軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 柚皮苷標準曲線繪制

以柚皮苷質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制柚皮苷標準，結果見圖1。由圖1可知，柚皮苷標準曲線回歸方程為y=7.564 0x+0.001 4，相關系數R2為0.995 2，結果表明二者線性關系良好。

圖1 柚皮苷標準曲線Fig.1 Standard curve of naringin

2.2 單因素試驗

2.2.1 柚苷酶添加量對胡柚果酒的影響

柚苷酶（naringinase）同時具有α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase）和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶的活性，能夠對柚皮苷進行特異性水解，使其轉化為無苦味的柚皮素[15]。由圖2可知，胡柚果酒的脫苦率隨著柚苷酶添加量在40～80 mg/L范圍內的增大而增加，胡柚果酒的酒精度也逐漸上升，但當添加量達到70 mg/L和80 mg/L時變化已經不大。考慮到胡柚果酒風格必須要帶有少許苦味，不需要將柚皮苷全部除去。因此，選擇柚苷酶添加量為70 mg/L。

圖2 柚苷酶添加量對胡柚果酒酒精度和脫苦率的影響Fig.2 Effects of naringinase addition on alcohol content and debittering rate of Huyou fruit wine

2.2.2 SO2添加量對胡柚果酒的影響

圖3 SO2添加量對胡柚果酒酒精度和脫苦率的影響Fig.3 Effects of SO2 addition on alcohol content and debittering rate of Huyou fruit wine

在發酵過程中添加適量的SO2可抑制雜菌的生長并保護果汁中的色素成分不被氧化，提高有機酸含量，降低揮發酸含量，改善果酒的味感質量[16]。由圖3可知，SO2添加量在30～40 mg/L有助于發酵基質酒精度以及脫苦率的提高；并且SO2添加量為40 mg/L時，酒精度及脫苦率最高，分別為13.6%vol和47.2%；SO2添加量＞40 mg/L之后，酒精度和脫苦率均開始下降，高濃度的SO2雖然充分抑制了雜菌，但是也抑制了一部分酵母，導致產酒能力變弱；由于加入SO2可以提高發酵基質的酸度，可能降低了柚苷酶的活性，導致酶解效率下降。此外，過多的SO2常常導致酒體辛辣、影響口感，甚至使成品酒的SO2含量超標，而過低的SO2含量抑菌效果差，可能引發發酵過程的雜菌污染。因此，選擇SO2添加量為40 mg/L。

2.2.3 酵母接種量對胡柚果酒的影響

圖4 接種量對胡柚果酒酒精度和脫苦率的影響Fig.4 Effects of inoculum on alcohol content and debittering rate of Huyou fruit wine

由圖4可知，隨著酵母接種量在4%～7%范圍內增大，發酵基質的酒精度及脫苦率呈現上升趨勢；當酵母接種量為7%時，酒精度達到最大，為14.6%vol，脫苦率為44.7%；當酵母接種量＞7%后，酵母增殖速度快，雖然前期發酵啟動快，但酵母過早衰亡導致后期發酵能力不足，酒精度反而下降，脫苦率隨酵母接種量增大而稍有上升，通過添加酵母，防止了氧化和有害微生物生長，使得發酵基質的酒精發酵更為徹底，產生的揮發酸、SO2和H2S等成分更少，有利于柚苷酶的酶解。因此，選擇酵母接種量為7%。

2.2.4 發酵溫度對胡柚果酒的影響

圖5 發酵溫度對胡柚果酒酒精度和脫苦率的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on alcohol content and debittering rate of Huyou fruit wine

酒精酵母最適生長溫度為25～30℃，溫度低，繁殖慢，溫度高，繁殖快。由圖5可知，隨著發酵溫度在20～28℃范圍內的增加，酒精度先升高后下降，并在溫度為24℃時酒精度達到最大值，為14.7%vol，脫苦率為43.3%；而溫度為26℃時，酒精度降低了0.8%vol，但脫苦率提高了2.4%。溫度低，酵母起酵速度慢，酒精度增長幅度小；溫度過高，酵母易早衰，導致發酵不徹底。脫苦率隨著發酵溫度在20～28℃范圍內呈現逐步上升趨勢，當發酵溫度為28℃時與最大值相比略有下降。因此，考慮到脫苦率為胡柚果酒的首要考核指標，將發酵溫度控制在26℃。

2.3 Box-Behnken響應面試驗

根據單因素試驗結果，以脫苦率（Y）作為響應值，考察發酵溫度（X1）、酵母接種量（X2）、柚苷酶添加量（X3）對胡柚果酒品質的影響。響應面設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

利用Deign-Expert 8.0軟件對試驗數據進行回歸模型方差分析，結果見表3。對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=44.88-0.71X1+0.43X2+1.11X3+0.42X1X2-1.65X1X3-0.22X2X3-

由表3可知，該回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.000 1），模型失擬項P=0.224 3＞0.05，因而無失擬因素存在。回歸方程決定系數R2為0.980 5、預測決定系數為0.7924與較正決定系數十分接近，精密度為18.993＞4。綜合以上分析，說明模型擬合度較好，可用于代替試驗真實點對試驗結果進行初步分析和預測。X3、X1X3、X12、X22對結果影響極顯著（P＜0.01），X1對結果影響顯著（P＜0.05）。各因素對脫苦率的影響大小依次為柚苷酶添加量（X3）＞發酵溫度（X1）＞酵母接種量（X2）。借助Design-Expert軟件獲得的三維響應面曲線見圖6。

圖6 發酵溫度、酵母接種量、柚苷酶添加量交互作用對胡柚果酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction of between fermentation temperature,yeast inoculum and pectinase addition on sensory evaluation of Huyou wine

由圖6可知，脫苦率隨著酵母接種量和發酵溫度的增加呈現先升高后下降的趨勢，等高線呈現橢圓形，存在極值，且坡度較陡說明交互作用顯著；隨著柚苷酶添加量和發酵溫度變化，脫苦率呈現出先升高后下降的趨勢，且坡度較陡交互作用顯著；隨著初柚苷酶添加量和酵母接種量的增加，脫苦率呈現出先升高后下降的趨勢，坡度相對較陡，交互作用較顯著。

用此回歸模型預測柚苷酶添加量為79.84 mg/L，發酵溫度為24.64℃、酵母接種量為6.99%時，胡柚果酒脫苦率理論值為46.84%。為方便實際操作，修改發酵工藝條件為柚苷酶添加量80 mg/L，發酵溫度25℃、酵母接種量7%，重復3次驗證試驗，得到脫苦率實際值為46.63%，酒精度為13.7%vol，與理論值符合良好，表明采用響應面法優化得到的最佳條件準確可靠。

3 結論

以新鮮胡柚為原料，利用選育出的釀酒酵母釀造胡柚果酒，從酒精度、脫苦率方面對釀造工藝進行了分析，經過單因素試驗與響應面優化分析得到胡柚果酒最佳發酵工藝條件：柚苷酶添加量80 mg/L、發酵溫度25℃、酵母接種量7%、SO2添加量40mg/L。在此優化工藝條件下，脫苦率達46.63%，酒精度為13.7%vol，釀造出的胡柚果酒香味優雅、苦味適中、口感柔和。該研究為弱苦味胡柚果酒的釀造生產提供了一定的參考意義。