埃博拉疫苗臨床試驗研究進展

張 哲，侯利華

1 埃博拉病毒

埃博拉病毒屬于絲狀病毒科，為單股負鏈RNA病毒，病毒顆粒直徑約80 nm，外有包膜。埃博拉病毒是引發埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）的主要病原體，主要分為扎伊爾型（Zaire）、蘇丹型（Sudan）、本迪布焦型（Bundibugyo）、塔伊森林型（Tay forest）和萊斯頓型（Reston）5種亞型[1]。該病毒在感染后會有3～21 d的初始潛伏期，隨后迅速出現發燒、頭痛、肌肉酸痛、腹瀉、嘔吐等癥狀，絕大多數患者最終會因多器官衰竭、出血、休克而死亡，死亡率高達50%～90%[2]。埃博拉病毒是一種極度危險的急性出血熱病毒。

2 埃博拉病毒病疫情

EVD疫情首次暴發于1976年剛果民主共和國（前扎伊爾），隨后在蘇丹、剛果共和國、加蓬、烏干達等非洲國家均有暴發，規模不一[3-4]。2014年，西非EVD疫情大規模暴發后，埃博拉病毒成為了全球的關注重點[5]。2017—2018年，剛果民主共和國先后又暴發2次EVD。截至2018年8月30日，該國EVD疫情仍未解除。

3 埃博拉疫苗

埃博拉疫苗是防止EVD傳播的有效手段。在設計疫苗時，通常以產生足夠保護效果的體液免疫和細胞免疫為目標，經過動物模型的驗證后，再進行臨床試驗。對于埃博拉病毒而言，包膜糖蛋白（glycoprotein, GP）在其感染和致病中具有關鍵作用，能被宿主細胞強烈識別。因此，現階段埃博拉疫苗的設計均是圍繞GP開展的，臨床評價中最常用的指標為GP特異性抗體水平。1980年，首個滅活埃博拉疫苗被證明能夠在豚鼠模型中實現免疫保護，但是這類疫苗在非人靈長類動物攻毒實驗中并沒有展現出較好的保護效果[6]。隨著EVD疫情的頻發及其規模的增大，越來越多的力量投入到埃博拉疫苗的研發工作中。截至目前，共有幾十余種埃博拉疫苗進入臨床前研究或臨床研究階段，主要類型包括DNA疫苗、蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗、復制子疫苗、復制缺陷型疫苗、重組病毒載體疫苗等[7-10]。重組病毒載體疫苗又分復制型和非復制型。目前，DNA疫苗、蛋白疫苗和重組病毒載體疫苗均已進入臨床試驗階段。

3.1 DNA疫苗 DNA疫苗通常是表達免疫原性抗原的質粒，具有易于開發，生產成本低，幾乎沒有感染風險的優點。美國國家過敏和傳染病研究所研發的DNA疫苗編碼3種已知亞型的埃博拉病毒的蛋白質粒：Sudan型GP、核蛋白（nuclear protein, NP）和Zaire型GP，在2002年底開展I期臨床試驗[11]。結果表明，20名接種疫苗的受試者均產生了至少針對1種蛋白的特異性抗體，其中有6名受試者產生了GP特異的CD8+T細胞反應。2008—2012年，該團隊又陸續開展了新改進DNA疫苗的I期和Ib期臨床試驗，以檢驗其安全性和免疫原性[12-13]。在美國開展的I期臨床試驗中，2組受試者分別接受了馬爾堡疫苗和埃博拉疫苗；而在烏干達開展的Ib期臨床試驗則設置了3個試驗組，分別為馬爾堡疫苗組，埃博拉疫苗組和同時免疫的二聯疫苗組。兩個臨床試驗結果均表明該DNA疫苗具有較好的安全性，并且能使部分疫苗接種者產生抗原特異性的體液免疫和細胞免疫應答。2015年，Inovio制藥公司和GeneOne Life Science公司合作開發的埃博拉疫苗INO-4212（包含編碼先前病毒株序列INO-4201和當前病毒株序列INO-4202兩種成分）進入I期臨床試驗（NCT02464670），在比較肌肉接種和皮膚接種的免疫效果的同時，還考察INO-9012（含IL-12 DNA序列）免疫刺激物的作用，但目前尚未見到相關研究結果的報道。盡管如此，DNA疫苗免疫程序復雜，效率相對較低，免疫原性弱等缺點，使其難以在大規模人群緊急預防接種中充分發揮作用。

3.2 蛋白疫苗 美國NOVAVAX公司根據Makona病毒株序列，研發了重組埃博拉病毒GP納米疫苗（Ebola GP Vaccine）。2015年7月，該公司公布了I期臨床試驗結果[14]。該試驗以遞增劑量使用或不使用Matrix-M佐劑，受試者接受1次或2次肌肉注射，并在免疫后28 d和35 d評價免疫反應。試驗結果初步證明該疫苗配合Matrix-M佐劑具有較好的免疫原性和耐受性。

3.3 非復制型病毒載體疫苗 重組病毒載體疫苗的優勢在于能夠快速表達目的抗原，激發較強的免疫反應。大部分病毒載體埃博拉疫苗表達的都是埃博拉病毒的GP。目前，已經進入臨床試驗階段的非復制型病毒載體埃博拉疫苗包括改良安卡拉載體埃博拉疫苗（MVA-BN Filo）、非復制型人26型腺病毒載體埃博拉疫苗（Ad26-ZEBOV）、復制缺陷型黑猩猩3型腺病毒載體埃博拉疫苗（ChAd3-EBO-Z）、復制缺陷型人5型腺病毒載體埃博拉疫苗（Ad5-EBOV）和埃博拉病毒病聯合載體疫苗（GamEvac-Combi）。其中Ad5-EBOV（中國）和GamEvac-Combi（俄羅斯）已經獲批在本國注冊。

3.3.1 MVA-BN Filo MVA-BN Filo由丹麥生物制藥公司Bavarian Nordic與美國國家過敏與傳染病研究所共同研發生產。該疫苗以改良痘病毒為載體，同時表達馬爾堡病毒、Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的GP以及Tay forest型埃博拉病毒的NP，被用作其他埃博拉疫苗接種后的異源加強免疫，能夠有效延長免疫反應的持續性。

3.3.2 Ad26-ZEBOV Ad26-ZEBOV由美國強生公司旗下制藥公司Janssen研制。在一項臨床前研究中，研究者對利用MVA-BN Filo與Ad26-ZEBOV以初免-加強免疫的方式進行研究，發現了較好的免疫效果，并由此展開合作推進疫苗開發的計劃。2016年4月，Milligan等[15]在美國醫學會雜志上發表了Ad26-ZEBOV首次免疫和MVA-BN Filo加強免疫的I期臨床試驗結果。該臨床試驗將87名受試者分為5組：2組分別在免疫Ad26-ZEBOV的28、56 d后進行MVA-BN Filo加強免疫；2組分別在免疫MVABN Filo的28、56 d后進行Ad26-ZEBOV加強免疫；1組為開放組，在免疫MVA-BN Filo的14 d后進行Ad26-ZEBOV加強免疫。研究結果表明，采用Ad26-ZEBOV初免和MVA-BN Filo加強免疫的方案能獲得較好的免疫效果。采用該接種方案加強免疫8個月后，所有接種疫苗的受試者體內抗體仍然維持在高水平。

3.3.3 ChAd3-EBO-Z ChAd3-EBO-Z由美國國家過敏與傳染病研究所研制，英國制藥企業葛蘭素史克公司合作開發。目前已經完成10余項I、II期臨床試驗研究。2014年9—11月，該疫苗陸續在美國、英國、馬里和瑞士開展臨床試驗項目[16-19]。在美國開展的首個I期臨床試驗探究了不同劑量的ChAd3-EBO-Z（2.0×1010vp和2.0×1011vp）的安全性和免疫原性，結果表明疫苗接種產生的免疫應答具有劑量依賴性，且以2×1011vp劑量免疫后產生的GP抗體水平處于已報道的非人靈長類實驗中疫苗誘導的保護性免疫范圍內[16]。在隨后的臨床試驗中，研究團隊對該疫苗的更多劑量以及采用MVA-BN Filo疫苗加強免疫策略的效果進行探索[19]。結果表明，異源加強免疫策略可以提高體液和細胞免疫反應，并且延長免疫應答的持久性。2015年1月，原計劃在利比里亞開展的III期臨床試驗由于招募人數不足，更改為擴大的II期臨床方案。試驗結果表明，疫苗接種12個月后抗體水平仍能基本維持[20]。

3.3.4 Ad5-EBOV Ad5-EBOV由中國人民解放軍軍事醫學研究院生物工程研究所和康希諾生物股份公司共同研發。疫苗的載體為復制缺陷型人5型腺病毒，表達2014型Zaire-Makona GP，疫苗劑型為凍干粉劑，其首個臨床試驗于2014年在江蘇泰州開展[21]。120名受試者按照1∶1∶1的比例隨機分至低劑量組（4.0×1010vp）、高劑量組（1.6×1011vp）及安慰劑組，接種后半年進行同源加強免疫，并繼續觀察1年[22]。研究結果表明，1.6×1011vp Ad5-EBOV單針接種能在免疫后14 d激發水平較高的特異性體液和細胞免疫。加強免疫后誘導產生的體液免疫反應，其水平要高于初次免疫，這種差異在高劑量組中更加明顯。加強免疫12個月后，高、低劑量組的抗體水平仍然維持在相對較高的水平。2015年3月，該團隊開展了針對在華非洲人群的I期臨床試驗，設置8.0×1010vp 和1.6×1011vp 2個劑量組，該劑量下疫苗在非洲人群中表現出較好的安全性和免疫原性[23]。同年10月，Ad5-EBOV塞拉利昂II期臨床試驗正式開展，共招募受試者500名，按一定比例隨機分至低劑量組（8.0×1010vp）、高劑量組（1.6×1011vp）和安慰劑組[24]。臨床試驗結果表明，Ad5-EBOV對于塞拉利昂健康成年人不僅安全，而且具有高度的免疫原性。同時，8.0×1010vp也是免疫的最佳劑量。

3.3.5 GamEvac-Combi 由俄羅斯研制的GamEvac-Combi是一種聯合疫苗，表達埃博拉病毒Makona GP的重組水皰性口炎病毒減毒株（VSV-GP）和復制缺陷型人5型腺病毒（Ad5-GP）。該疫苗目前完成一項I/II期合并進行的臨床試驗[25]。在I期方案中，各有12名受試者接受VSV-GP或Ad5-GP的免疫，評價疫苗的安全性；在II期方案中，將60名受試者均分至半劑量組和全劑量組中，每組受試者在免疫VSV-GP 21 d后，進行Ad5-GP免疫。臨床試驗為GamEvac-Combi的安全性和免疫原性提供了較好的數據支持。該疫苗目前在幾內亞和俄羅斯開展IV期臨床試驗，預計招募受試者人數為2000名。

3.4 復制型病毒載體疫苗 美國Profectus公司和Merck公司均開發了以水皰性口炎病毒為載體的埃博拉疫苗。前者（Rvsv N4CT1 EBOVGP1 vaccine）在2016年完成了I期臨床試驗（NCT02718469），而后者（rVSV-ZEBOV）則是目前為止臨床試驗進度最快，研究數據最豐富的埃博拉疫苗，臨床試驗情況見表1。rVSV-ZEBOV由加拿大公共衛生署開發，授權給NewLink Genetics公司（產品名BPSC-1001），后者開始疫苗的初期臨床試驗和GMP車間生產。隨后，又轉讓給Merck公司（產品名V920），從事疫苗的后期開發工作。2015年，該疫苗率先在幾內亞完成III期臨床試驗。2018年5月，剛果民主共和國新發EVD疫情，Merck公司先后向WHO提供疫苗共計15 000余份，實施環形接種，防止疫情進一步擴散。下面將從安全性、免疫原性、長期有效性和整合免疫學研究方面對此疫苗展開介紹。

3.4.1 安全性 作為減毒活疫苗，rVSV-ZEBOV的安全性一直是人們關注的重點。2014年10—11月，該疫苗I期臨床試驗在美國、非洲和歐洲開展，免疫劑量從3.0×103～1.0×108PFU不等[26-27]。在美國開展的臨床試驗中，最常見的不良事件為注射部位疼痛、肌肉酸痛以及疲勞。在非洲和歐洲臨床試驗中，免疫劑量在3.0×106PFU以上的110名受試者中有103名（94%）在免疫后3 d仍存在疫苗的病毒血癥。免疫后第2周，瑞士51名受試者中有11名（22%）發生關節炎，平均疼痛持續時間為8 d。因為這些不良事件，該臨床試驗于2014年12月暫停，研究團隊重新評估安全性。1個月后該臨床試驗重新啟動，招募部分受試者并將免疫劑量調整為3.0×105PFU。結果表明，降低疫苗劑量可顯著降低急性反應，但不能避免關節炎等癥狀，且會導致抗體反應水平下降[28]。同時，德國和肯尼亞臨床試驗的40名受試者中有2名（5%）出現自限性疾病，并且分別在另外2名受試者的滑膜液和皮膚水泡中檢出病毒，這也證實了水皰性口炎病毒在外周組織中的傳播和復制。在另外兩項I期臨床試驗中，大多數不良事件發生在接種疫苗后的第1 d，強度為輕度至中度，持續時間較短，并且也都在疫苗接種后觀察到了短暫、低水平、劑量依賴性的病毒血癥，沒有與疫苗或受試者退出相關的嚴重不良事件報告[30-31]。由于在所有I期臨床試驗中均沒有與疫苗相關的嚴重不良事件報告，最終將2.0×107PFU確定為該疫苗的合適免疫劑量，隨后開展的II期和III期臨床試驗均采用該劑量。

2015年7月，評價rVSV-ZEBOV安全性的III期臨床試驗在美國開展[35]。1197名受試者按照2∶2∶2∶2∶1的比例隨機分至聯合批次組（3組）、高劑量組（1組）或安慰劑組（1組），分別用3批同劑量疫苗（2.0×107PFU），單批高劑量（1.0×108PFU）或安慰劑進行接種。在接種后第1～42 d記錄每日體溫和不良事件，在接種后6個月記錄嚴重不良事件。結果表明各組觀察到發熱的比例分別為20.2%（聯合批次組）、32.2%（高劑量組）和0.8%（安慰劑組）。免疫后第1～42 d各組不良事件發生率為關節痛17.1%、20.4%和3.0%，關節炎5.1%、4.2%和0.0%，皮疹3.8%、3.8%和1.5%。共報告21例嚴重不良事件和2例死亡，經評估均與疫苗無關。該臨床試驗進一步為rVSVZEBOV提供了安全性數據支持。

表1 rVSV-ZEBOV埃博拉疫苗的臨床試驗情況Table 1 Clinical trials on rVSV-ZEBOV

3.4.2 免疫原性 美國I期臨床試驗中，2.0×107PFU與1.0×108PFU的rVSV-EBOV免疫效果相當，均顯著優于3.0×106PFU[24]。利比里亞II期臨床試驗比 較 了 2.0×107PFU rVSV-ZEBOV與2.0×1011vp Ad26-ZEBOV的免疫效果[20]。免疫后1個月，rVSVZEBOV組GP抗體幾何平均值為1000 EU/ml，陽性率為83.7%；Ad26-ZEBOV組GP抗體幾何平均值為627 EU/ml，陽性率為70.8%。免疫后12個月，rVSV-ZEBOV組GP抗體幾何平均值為818 EU/ml，陽性率為79.5%；Ad26-ZEBOV組GP抗體幾何平均值為474 EU/ml，陽性率為63.5%。這些結果表明rVSV-ZEBOV在免疫后1個月至1年均能保持較高的抗體水平，其免疫效果要優于Ad26-ZEBOV。

2015年4月，在塞拉利昂開展了一項單劑量的rVSV-ZEBOV II/III期臨床試驗，實際接種人數8016人，其中有539名受試者參加了免疫原性研究[33]。同年，rVSV-ZEBOV的III期臨床試驗在幾內亞開展[32]。該試驗采用了“環形接種”策略：圍繞每個新發EVD病例的密接者及其接觸者形成環形人群，設置立即接種組和延遲接種組（延遲21 d接種）。中期臨床分析結果表明，在接種10 d后，立即接種組未出現感染病例，而延遲接種組則出現16例感染病例，2組結果比較，差異有統計學意義（P=0.045）。這表明rVSV-ZEBOV具有較好的保護性。

加強免疫能夠有效提高疫苗免疫效果，增加免疫反應的持續性。Ad26-ZEBOV的異源加強免疫和Ad5-EBOV的同源加強免疫策略都獲得了較好的免疫效果。在I期臨床試驗中，部分受試者在接種rVSV-ZEBOV 28 d后接受同源加強免疫[26]。盡管在隨后的28 d內加強免疫組受試者的體液免疫反應水平有所上升，但在初免180 d后2組受試者的體液免疫反應水平已經沒有顯著性差異。這表明同源加強會在短期內提高體液免疫反應水平，但無法改變免疫反應的持久性。此外，另一項臨床試驗（NCT02876328）正在考察免疫180 d后進行同源加強免疫的免疫效果和免疫持久性。

3.4.3 長期有效性 目前已經完成rVSV-ZEBOV最長時間為2年以上的免疫反應觀察。這些受試者來自于2014年非洲和歐洲I期臨床試驗，分別接種過3.0×105PFU、1.0×107PFU和5.0×107PFU劑量的rVSV-ZEBOV，其中瑞士受試者觀察至2年，肯尼亞和加蓬受試者觀察至1年[27，29，32]。初免2年后，參與隨訪的95名瑞士受試者（共102名）中，曾接種1.0×107PFU或5.0×107PFU劑量疫苗且初免28 d時血清反應陽性的44名受試者體內血清反應陽性率為100%（44/44），接種3.0×105PFU劑量疫苗的則為89%（33/37），這些受試者的抗體滴度水平與初免180 d后的水平相當。參與隨訪的肯尼亞和加蓬各劑量組受試者初免后1年的抗體滴度水平也與初免90 d后的水平相當。此外，利用多變量方法進行統計學分析發現，初免6個月以后的抗體水平可以通過疫苗劑量和疫苗相關性關節炎來預測[32]。研究結果表明一定劑量rVSV-ZEBOV接種可以產生持續性抗體反應，疫苗在無法進行加強免疫時也能發揮保護效果。美國臨床試驗數據庫顯示，有多項rVSV-ZEBOV臨床試驗（NCT02788227，NCT03140774）正在開展中，旨在探索該疫苗的長期免疫反應。

3.4.4 整合免疫學研究 臨床試驗中，研究者通常利用血清學和細胞免疫學檢測技術獲取疫苗免疫反應信息。rVSV-ZEBOV是目前惟一將常規免疫學數據和不同層次的組學數據進行整合分析的埃博拉疫苗[36]。在美國I期臨床試驗中，Fouzia團隊檢測了ZEBOV-GP特異的循環濾泡輔助T細胞，并發現其與抗體滴度以及濾泡T輔助細胞亞群水平顯著相關[37]。德國完成的I期臨床試驗中，Dahlke 等[38]發現相比其他2組受試者，2.0×107PFU劑量組受試者能引發更強大的細胞因子互鎖網絡，這也是rVSV-ZEBOV的首個細胞介導免疫譜；而Rechtien等[39]則針對2組高劑量受試者的樣本，利用系統疫苗學來尋找rVSV-ZEBOV的早期先天免疫反應信息，通過多細胞因子水平、天然免疫細胞亞群和基因表達的整合分析，發現IP-10與rVSV-ZEBOV誘導的天然免疫反應密切相關。在另外2項臨床試驗中，Angela團隊通過分析受試者血漿樣本中細胞因子水平變化的特征，揭示了單核細胞可能在rVSV-ZEBOV安全性和免疫原性方面發揮重要作用[40]。這些研究表明，通過整合多方面數據進行免疫學研究，可以更好地理解疫苗誘導免疫反應的機制和關鍵因素，有利于鑒定和預測疫苗誘導免疫應答的水平。

4 結 語

2014年西非大規模暴發的EVD疫情將多個埃博拉疫苗快速推向臨床研究階段（見表2）。目前看來，病毒載體埃博拉疫苗具有較好的前景。該類疫苗誘導的免疫反應具有響應快、水平高、持續較久的優點，尤其是rVSV-ZEBOV，已經成功在西非人群中證明了其較好的保護效果。考慮到非洲大部分地區經濟水平相對落后，電力系統難以保障，液體制劑疫苗的冷鏈運輸和保存是其須要重點解決的問題之一。此外，未來埃博拉疫苗的臨床研究可能須要關注以下幾個方面。①根據免疫需求，進一步探索疫苗預防性接種和暴露后接種的保護效力；②針對不同人群，調整免疫策略以實現的免疫反應的快速性和持久性；③利用系統疫苗學，對臨床數據進行充分挖掘，解讀疫苗免疫標志物，以指導疫苗的設計優化和免疫反應的預測。

表2 各類埃博拉疫苗的優缺點Table 2 Advantages and shortages of different Ebola vaccines