尼帕病毒病的流行現狀與防治研究進展

李國華，王化磊，張 穎，馮 娜，楊松濤，夏咸柱

副粘病毒科病毒能引起人和多種動物發病，其中感染人的主要有麻疹病毒、腮腺炎病毒和風疹病毒；感染動物的病毒主要有新城疫病毒、犬瘟熱病毒和牛瘟病毒；人獸共患病病毒有亨德拉病毒（Hendra virus, HeV）和尼帕病毒（Nipah virus,NiV）。尼帕病毒病（Nipah virus disease, NVD）于1998年9月底在馬來西亞霹靂州怡保市附近暴發，之后又在森美蘭州的兩個地區暴發。該病的臨床表現為高熱、頭痛、腦炎和呼吸系統癥狀，起初被認為是乙型腦炎，但采取滅蚊和免疫等措施后，疫情并沒有得到控制。持續到1999年7月中旬，該國確診病例至少有265例，其中105例死亡，病死率達到40%[1]。1999年3月份分離出病毒，電鏡觀察發現該病毒呈副粘病毒特征。測序結果顯示，病毒與HeV同源性高。確診病原后，馬來西亞政府采取措施，撲殺110萬頭豬后未出現新發病例，成功控制了該病在人群中的流行。2001年NVD分別在印度和孟加拉國暴發。截至到目前印度共暴發3次NVD疫情，分別在2001，2007和2018年。2018年的這次疫情暴發于5月17日，截止到7月2日，共有19例報告病例（其中18例為實驗室確診病例），17例死亡（WHO統計數據），病死率約94%。而在孟加拉國，自2001年首次暴發后，NVD幾乎每年都有暴發，這可能與該病毒的遺傳特性發生了變化或居民生活習俗差異有關。我國與印度接壤，并和孟加拉國鄰近，雖然還沒有病例報道，但該病具有傳入我國的風險。為此，及早了解NVD的流行現狀和防治研究進展，為我們以后成功應對突發傳染病具有重要意義。

1 病原學

NiV是單股負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科亨尼帕病毒屬，另一個同屬的病毒是1994年在澳大利亞布里斯班發現的HeV[2]。NiV粒子為多形性、球形、絲狀，有囊膜，尺寸在40～1900 nm之間，基因組18 246 nt，比HeV多12個堿基，編碼至少N、P（C/V）、M、F、G、L 6種蛋白（圖1）。其中N、P、L蛋白結合在病毒RNA上，與病毒基因組的轉錄和復制有關，M蛋白參與維持病毒囊膜形態，F、G蛋白參與蛋白的融合和吸附，與病毒入侵有關[4]。N基因高度保守，可作為PCR診斷的靶片段[1]。NiV主要有2個遺傳譜系：NiV馬來西亞株（NiV Malaysia, NiV-MY）和NiV孟加拉株（NiV Bangladesh, NiV-BD）。其中NiV-MY株基因組18 246 nt，而NiV-BD株基因組18 252 nt[5]。

圖1 亨尼帕病毒結構圖[3]Figure 1 Structure of Henipa virus[3]

2 流行病學

NVD病死率高，在40%～75%之間。在1998年9月底—1999年7月中旬馬來西亞暴發的NVD疫情中，病死率達到40%[1]。1999年3月，新加坡確診病例11例，死亡1例[6]。之后，印度在2001年、2007年和2018年均暴發了NVD疫情，孟加拉國從2001—2012年，幾乎每年均發生NVD疫情，兩國2001—2012年疫情病例總數為280例，死亡 211例，病死率高達75%[5]。亨尼帕病毒暴發和果蝠活動范圍分布見圖2。

據調查NiV的傳染源是果蝠，主要通過兩種方式傳播：一種是傳給中間宿主豬，豬再通過接觸傳染給人；另一種是通過污染椰棗樹的椰棗汁傳染給人[8-9]。另外，健康人與患者密切接觸也可能感染[10]。

圖2 亨尼帕病毒暴發和果蝠活動范圍分布圖[7]Figure 2 Henipa virus outbreaks and Pteropus distribution map[7]

在馬來西亞，NiV主要通過中間宿主傳播。暴發地居民將豬舍建在果樹旁。果蝠是NiV的主要貯存宿主，感染NiV的果蝠采食樹上的果子時，其唾液、尿液污染的未吃完的果子和殘渣掉入豬舍后被豬采食，而后豬感染病毒。發病期的豬的糞便、尿液等分泌物又通過直接接觸感染其他宿主。然而豬的發病率并不高，在5%左右[1]。人在處理病死豬時，接觸到病死豬的糞便、分泌物等，經過6～21 d的潛伏期后出現高熱、頭痛等腦炎癥狀，有部分患者出現咳嗽等呼吸系統癥狀。臨床上，NVD容易和流行性乙型腦炎混淆，但NiV感染的人不分年齡，嬰幼兒和成年人均可發病，且病死率高，而流行性乙型腦炎主要感染兒童，感染后病死率低，這是兩者的區別[4]。感染者與豬密切相關，馬來西亞的感染者主要是養殖場工人，新加坡的感染者全都是屠宰場工人。

孟加拉國和印度疫情暴發主要是居民飲用了被NiV污染的椰棗汁。該地區的居民具有飲用椰棗汁的傳統，常在秋冬季采集新鮮椰棗汁直接飲用或發酵后飲用。為了收集椰棗汁，居民先將椰棗樹削皮，然后插入引流管過夜收集汁液。椰棗汁口感甜美，果蝠夜間常來舔食樹干上的汁液，當NiV陽性果蝠的分泌物如唾液、尿液、糞便等落入椰棗汁中，人飲用后會導致感染發病[12]，疫情暴發多集中在9月到來年3月間。

人際間傳播是NVD在孟加拉國和印度流行的又一大特征。2001年印度西里古里暴發的NVD疫情顯示，先后感染的病例集中在患者去過的醫院，該次疫情死亡45例（確診66例）[12]。2004年孟加拉國福里德布爾的疫情中，當地一個知名的宗教領袖感染NiV后，探望者眾多，導致22人感染[9]。Luby等[13]統計了2001—2007年間孟加拉國的病例，其中51%（62例）的病例是密切接觸其他患者后感染了NiV。調查發現呼吸道分泌物是人際傳播病毒的主要載體，而且呼吸困難的患者更容易傳播病毒[11，13-14]。

副粘病毒大多數成員感染動物有特異性，一般不跨物種感染。但NiV能感染多種動物，如豬、馬、貓、狗等均可感染。NiV宿主范圍廣是因為它以肝配蛋白B2/B3（ephrin B2/B3）作為進入細胞的受體，肝配蛋白B2/B3參與調節神經系統和紅細胞的發育，廣泛分布在內皮細胞和神經細胞表面，而且在哺乳動物中高度保守[5，15-16]。

孟加拉國頻繁發生NVD疫情，可能跟病毒遺傳特性和發生改變的傳播方式有關。Mire等[17]用非洲綠猴攻毒實驗顯示NiV-BD株致病力強于NiV-MY株。這提示我們在接觸到疑似病例時要注意做好個人防護。Harcourt等[18]分析了NiVMY和NiV-BD株病毒，兩者全基因序列同源性為91.8%，編碼蛋白區的序列同源性比非編碼區高。4株孟加拉國分離株的N基因開放閱讀框序列同源性為99.1%，而馬來西亞分離株不同株之間的同源性幾乎完全一致，基因上的這些差異可能反映了疫病在兩個國家傳播模式的不同。

3 臨床癥狀

馬來西亞和新加坡患者主要表現為發熱、頭痛、頭暈和嘔吐，52例（55%）患者意識水平下降，明顯表現出腦干功能障礙。典型臨床癥狀有節段性肌陣攣、反射消失、張力減退、高血壓和心動過速等。腦電圖檢查，有彌漫性慢波伴隨雙側尖波[19]。MRI掃描后可見急性期大腦皮層下和白質廣泛局灶性損傷[20]。而孟加拉國和印度患者呼吸系統癥狀比例較高，占總病例數的50%～66%，馬來西亞患者中約占29%[5]。

4 病理變化

病理學檢查發現，NVD的病變主要發生在患者的神經系統和呼吸系統。其病理學基礎是病毒感染血管內皮細胞導致多器官血管炎。受感染血管的內皮細胞逐漸融合成多核巨細胞，其他內皮細胞則被溶解脫落進入血管內。血管內皮細胞損傷，形成血栓，堵塞毛細血管，導致臟器缺血。受影響的器官由于被堵塞而出現點狀皮下出血。血管炎會通過內皮細胞損傷、血管壁的纖維化壞死、出血或血栓影響小動脈、小葉和毛細血管的正常功能。在大腦、肺和腎小球等臟器血管的內皮細胞中能看到巨細胞合胞體。病變血管內皮細胞周圍的神經元也出現退行性病變、胞質嗜酸性和核內包涵體。免疫組織化學（免疫組化）染色顯示病變內皮細胞周圍的神經元、神經膠質細胞、支氣管上皮細胞和肺泡里也有NiV[1]。

NVD導致一系列臨床癥狀和病理變化，與NiV進入細胞的方式和逃避機體免疫防御系統有關。NiV進入細胞包括吸附和膜融合2個主要過程，首先參與吸附的糖蛋白NiV-G結合到細胞表面受體肝配蛋白 B2/B3上，觸發F（融合）蛋白構象發生改變，發揮膜融合功能，從而使NiV核酸進入細胞內。經Liu等[21]研究表明，NiV-G觸發膜融合的機制主要分3步，即受體介導的NiV-G糖蛋白按時空性依次發生構象變化，其中2個構象變化在NiV-G蛋白頭部，1個在NiV-G頸部。實驗表明，無頭部突變株也能激發NiV-F發生膜融合，2個頭部的構象改變可暴露頸部特異性結構域。而且，NiV-G頭部只有與特異受體結合后，才會觸發膜融合，正常情況下NiV-G頭部通過隱藏頸部結構域避免過早觸發NiV-F的膜融合。

病毒能在宿主細胞成功復制，一般均有相應的逃避宿主免疫系統的策略。已證實NiV的P蛋白（NiV-P）、V蛋白（NiV-V）和W蛋白（NiV-W）能阻斷I型IFN信號傳導并結合信號傳導及轉錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1,STAT1）蛋白。NiV-W蛋白通過阻礙核內STAT1，阻斷Toll樣受體3依賴的IFN刺激基因誘導、TANK結合激酶1/NF-κB抑制因子ε介導的干擾素調節因子3活化來抑制宿主IFN應答。突變NiV-P及其基因表達產物不能去除病毒對IFN的抑制作用，說明還有其他蛋白或通路在調控。Bharaj等[22]研究發現，NiV基質蛋白M通過結合E3-泛素連接酶TRIM6，能抑制NF-κB抑制因子ε介導的I型IFN抗病毒作用，從而導致病毒增殖傳播。

5 實驗室診斷

因NiV屬于生物安全4級病毒，相關病原操作均要在相應安全級別的實驗室中進行或者對病原滅活后再進行操作。有多種診斷NiV感染的方法，包括RT-PCR法、ELISA法、中和試驗、免疫組化、分離病毒法及電鏡觀察法等。RT-PCR法檢測快速，可以根據美國國家生物技術信息中心中公布的NiV全基因組序列，選擇NiV高度保守的N基因設計引物，進行擴增鑒定。

ELISA法簡便準確，也常用于檢測血清或腦脊液中的抗體。Danids等[23]2000年用捕獲ELISA法檢測患者腦脊液中的IgM抗體為陽性。CDC也用ELISA法和捕獲ELISA法檢測IgG和IgM，并成為馬來西亞NiV檢測的有效方法。中和試驗是公認的檢測方法，可在RT-PCR和ELISA法篩查為陽性時，用血清中和試驗做進一步確診。

病毒分離和電鏡觀察是最直觀的檢測方法。Chua等[19]1999年將2例疑似感染患者腦脊液接種Vero細胞，5 d后細胞出現合胞體現象，分離出NiV。之后又對NiV進行了一系列觀察鑒定，電鏡負染法觀察NiV核衣殼形態呈絲狀“鯡魚骨”形（圖3A），有NiV從細胞膜上出芽（圖3B），細胞外完整病毒粒子多形性，直徑約500 nm（圖3C）。采集人腦組織進行免疫組化觀察鑒定，并對NiV進行了基因測序和遺傳進化分析[1]。

圖3 NiV細胞分離株電鏡負染超微結構圖[1]A.NiV核衣殼（鯡魚骨形）；B.NiV出芽；C.細胞外病毒形態；標尺.100 nmFigure 3 Ultrastructural structure of Nipah virus isolated strain in cell culture by negative stain electron microscope[1]

6 防 治

NVD作為危害人類和動物健康的烈性傳染病，目前還沒有可供使用的特效藥。特異性抗體實驗在非人靈長類動物中效果良好，但還未上市。以多種病毒為載體構建的重組NiV疫苗也在試驗中，除針對馬HeV的亞單位疫苗上市外，其他均無上市疫苗[24]。

小動物實驗研究發現抗體療法效果不錯，但大多數實驗均在動物出現臨床癥狀前就給予抗體治療，不能反映出現臨床癥狀后給予抗體療法的效果。Geisbert等[25]評估了人源單克隆抗體m102.4的治療效果。將16只非洲綠猴隨機分成4組，每組4只，第4組為對照組。對這16只非洲綠猴全部氣管內攻致死劑量的NiV-MY株，然后前3組分2次注射m102.4抗體治療（15 mg/kg），第1組在攻毒后的第1 d和第3 d，第2組在攻毒后的第3 d和第5 d，第3組在攻毒后的第5 d和第7 d分別注射抗體治療，第4組作為對照不注射抗體。8～10 d后，未注射抗體的猴均發病，注射了抗體的12只猴均存活。第5 d才首次注射抗體的第3組非洲綠猴雖然發病，但在第16 d均恢復了健康。結果表明m102.4抗體療法在非人靈長類動物體內具有良好的治療效果，具備用于人NiV感染治療的潛力。該研究顯示抗體對NiV-MY株有明顯療效，但是否能夠成功控制強毒NiV-BD株還不清楚，須要進一步實驗確定。

許多在研疫苗在小動物和非人靈長類動物模型上的實驗表明，可完全預防NiV感染。這些候選疫苗利用痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、麻疹病毒及水皰性口炎病毒作為載體，將NiV-G基因插入其中，獲得的重組毒免疫倉鼠、豬、水貂等動物，然后攻毒保護，獲得了較理想的保護效果。其中用水皰性口炎病毒做載體構建的重組疫苗效果更為明顯，目前已證明能給倉鼠、水貂及非洲綠猴提供保護[26-29]。

上市的馬用亞單位疫苗Equivac? HeV具有交叉保護非洲綠猴免受NiV感染的能力。用可溶性HeV G蛋白亞單位加氫氧化鋁膠佐劑（Alhydrogel?）和CpG寡聚脫氧核苷酸2006（CpG ODN 2006，即含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸）佐劑作為疫苗，0 d和21 d分別通過肌肉注射免疫非洲綠猴，然后氣管內接105TCID50（50%組織細胞感染量）NiV，10 d后結果顯示，免疫組獲得了完全保護。免疫組非洲綠猴沒有表現出任何臨床癥狀，未檢測到病毒核酸；對照組則表現出食欲減退，行為異常，呼吸窘迫等一系列臨床癥狀[30]。實驗表明HeV G亞單位疫苗具有良好的交叉保護作用。遇到緊急情況時，可以考慮用該亞單位疫苗防控NVD。另外，制定免疫計劃首先應當把家畜列入其中，比如NVD疫情流行地區的豬、馬等[5]，攜帶病毒的動物減少了，人類才能更安全。以HeV G蛋白制備的亞單位疫苗Equivac? HeV已于2012年12月在澳大利亞上市，用于防控馬匹HeV感染，目前已用于12萬匹馬的免疫，效果良好。目前構建的候選疫苗主要是DNA疫苗、重組活載體疫苗，實驗顯示具有良好的保護力。這些候選疫苗以特異性體液免疫為主，刺激機體產生特異抗體，而非特異性先天免疫可能存在不足。上述候選疫苗和七肽重復區（heptad repeat region, HR）衍生多肽聯合使用，或許可以增強疫苗的非特異免疫效果。NiV-F蛋白裂解后活化的F1蛋白通過2個七肽重復區HR1/HR2組成六螺旋束狀結構（six-helix bundle, 6HB），參與膜融合。HR衍生多肽是HR1/2類似物，可以干擾6HB的形成，從而阻止病毒進入細胞。

鑒于可靠療法還未出現，物理化學預防仍是控制該病的有效手段。在NVD威脅地區工作的人員，建議做好個人防護，如戴口罩、護目鏡、手套，穿長袖工作服和長筒靴，勤洗手，常對工作物品進行消毒。在養殖場工作的人員，應避免動物采食被果蝠咬過的水果，并合理控制養殖密度。養殖場應遠離易吸引蝙蝠的果園。疫區居民勿飲用被污染的椰棗汁，或收集椰棗汁時在周圍加蓋遮擋物，防止椰棗汁被蝙蝠分泌物、糞便污染[31]。

我國雖然還沒有NVD疫情暴發，但新疆、云南、西藏毗鄰印度，鄰近孟加拉國，具有被傳入的風險。另外隨著與世界各國往來交流日益頻繁，也增加了NVD傳入我國的風險。因此隨時關注該病的流行發展動態，提前著手準備，研制高效的疫苗和特異藥物，對防控NVD傳入我國，保障人們健康、維持經濟繁榮等具有重要意義。