基于高效液相色譜的景邁山曬青毛茶指紋圖譜的初步研究

◎ 伍旭東，車 濤，陳 保，劉新月，呂 生

（普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 普洱 665000）

景邁山位于云南省普洱市瀾滄縣，地處高原山區(qū)，地貌類型多樣，氣候類型復(fù)雜，氣溫垂直落差異常顯著，其自然條件非常適宜茶樹的生產(chǎn)，且大部分茶園為古樹茶園。不同地區(qū)所產(chǎn)的曬青毛茶在品質(zhì)上差異較大，而曬青毛茶是普洱茶的主要原料，它的好壞決定了普洱茶品質(zhì)的優(yōu)劣。

目前，茶葉品質(zhì)主要從外形和內(nèi)質(zhì)兩方面進(jìn)行感官評價，其中內(nèi)質(zhì)評價指標(biāo)，包括香氣、湯色、滋味和葉底四方面。同時，也通過茶氨酸、咖啡堿和兒茶素類等幾個主要成分的含量來判斷茶葉的品質(zhì)。但是，僅通過簡單的感官審評以及幾個成分來判定茶葉品質(zhì)，尤其是原產(chǎn)地和非原產(chǎn)地茶葉，說服力不足，無法真正判定原產(chǎn)的茶葉與非原產(chǎn)的茶葉的區(qū)別，也就無法消除非原產(chǎn)地茶葉對原產(chǎn)地茶葉的侵害。為此，借鑒目前廣泛應(yīng)用于中藥品質(zhì)評定和質(zhì)量控制的指紋圖譜技術(shù)，建立一套綜合的補充評鑒系統(tǒng)，以判定茶葉品質(zhì)，區(qū)別茶葉產(chǎn)地[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗材料

本實驗所采用的茶樣均由實驗者購于景邁茶區(qū)，為2012年曬青毛茶（春茶），共10個批次，編號為S1-S10。

1.1.2 試劑

沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、咖啡堿、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、茶葉堿（美國sigma公司）；茶氨酸（純度99.7%）、沒食子酸（GA）標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙睛、甲醇、三氟乙酸（美國J.T.Bake試劑公司），HPLC級。

1.2 設(shè)備

日本SHIMADZU LC-20AD液相色譜儀，DGU-20A5脫氣系統(tǒng)，SPD-M20A二級管陣列檢測器，LCsolution液相色譜工作站；Diret-Q5型超純水機，法國Milipore公司；AS3120A型超聲清洗儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PV-1型小型旋渦混勻器，德國IKA公司；M27942B型移液槍，德國eppendorf公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金華市榮華儀器制造有限公司。

1.3 供試樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取茶葉樣品1.0 g，加入100 mL 60%甲醇，80 ℃水浴超聲提取20 min，濾紙過濾，定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾后備用。以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、兒茶素（+）C、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）5種兒茶素及咖啡堿為標(biāo)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行定性，每個樣品重復(fù)5次進(jìn)樣[2]。

色譜條件如下：色譜柱，Aglient poroshell 120 EC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流動相，A相為0.05%三氟乙酸，B相為純乙腈；梯度洗脫，60 min 內(nèi)完成，洗脫梯度見表1；流速，1 mL/min；進(jìn)樣量，5 μL；檢測波長280 nm。

表1 高效液相色譜洗脫梯度表

2 方法學(xué)考察

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品試驗

取一定量的混標(biāo)溶液，按1.3.1的色譜條件進(jìn)樣分析，得到色譜圖1，由圖1可知，各組的分離度良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色圖譜R圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性試驗

分別精密吸取不同濃度的對照品溶液依次按1.3.1色譜條件進(jìn)樣，測定各色譜峰的峰面積，以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]，得9種組分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。實驗結(jié)果表明，兒茶素、沒食子酸咖啡堿在所測濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性試驗結(jié)果表

2.2.2 精密度

在相同的色譜條件下，同一標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)進(jìn)樣測定6次，檢測得出標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離圖譜和各色譜峰的峰面積[4]。測定結(jié)果表明，所有標(biāo)準(zhǔn)品的相對保留時間的RSD（%）都小于0.5，相對峰面積的RSD（%）都小于4.0，表3結(jié)果表明所建立的高效液相色譜色譜法用于茶葉的分析具有良好的精密度，符合檢測方法對精密度的要求。

表3 精密度、穩(wěn)定性試驗表

2.2.3 重復(fù)性

取同一標(biāo)樣，分別在0、2、8、12、24、36 h按1.3.1色譜條件進(jìn)樣，每個時段連續(xù)進(jìn)樣測定6次，得出各色譜峰的峰面積[5]。分析結(jié)果表明，所有標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間的RSD（%）小于1.1，相對等面積的RSD（%）小于3.0，符合檢測方法對穩(wěn)定性的要求，見表3。

3 結(jié)果分析

分別將10批樣品的指紋圖譜輸入國家藥典委員會開發(fā)的《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004A）》中，設(shè)置第1批樣品為參照圖譜，對照圖譜生成方法采用中位數(shù)法，時間窗寬為0.10，多點校正后自動匹配，生成對照指紋圖譜。最后確定咖啡堿和兒茶素的出峰時間，得到10批次樣品的色譜疊加圖和對照指紋圖譜。匹配數(shù)據(jù)見表4。用咖啡堿和兒茶素作對照，并將樣品HPLC圖譜與混合對照品的色譜圖反復(fù)對比，對指紋圖譜中部分共有指紋峰進(jìn)行確認(rèn)。

表4 生成對照圖譜的匹配數(shù)據(jù)表

3.1 10個樣品指紋圖譜的相似度

由表5可知，10個茶樣的高效液相色譜圖相似度極高，選擇樣品S6為參照，差異性最大的S2也有95.8%的相似度，差異性不顯著。以標(biāo)準(zhǔn)圖譜R為對照，差異性最大的S2也達(dá)到92.6%的相似度，本試驗中的10個樣品的相似度非常高[6]。

表5 10個茶樣的相似度表

3.2 10個茶樣的標(biāo)準(zhǔn)圖譜與其他茶樣圖譜的差異

將6個不同地方的2012年曬青毛茶（春茶）和1個景邁古茶山的2012年曬青毛茶（春茶）按上述方法處理后進(jìn)樣[7]，得到的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜R進(jìn)行比較分析，6個測試樣品的的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜R相似度范圍為76.2%～84.3%，1個景邁山茶樣的圖譜與R的相似度達(dá)到94.6%，詳見表6。

表6 不同茶樣的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜R的相似度表

4 結(jié)語

本分析方法一次性分離景邁古茶山曬青毛茶中的沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、咖啡堿、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、茶葉堿9種成分，以這9種成分作為分析的主要對象，構(gòu)建了景邁古茶山曬青毛茶的標(biāo)準(zhǔn)圖譜R，以R為參照，對其他產(chǎn)區(qū)的曬青毛茶進(jìn)行比較分析，差異較明顯。利用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)圖譜R能夠很好地甄別景邁古茶山曬青毛茶的真?zhèn)危矠楹罄m(xù)普洱茶指紋圖譜的研究奠定了基礎(chǔ)。