沙門氏菌盲樣考核鑒定分析與質量控制

肖明理 毛露濤

（廣元市食品藥品檢驗檢測中心 四川 廣元 628000）

1.材料與方法

1.1 質控盲樣

由中國食品藥品檢定研究院下發，共收到NIFDC-PT-135R的三份巧克力樣本，編號分別為0212、0018、0619，裝量約為10g，采用玻璃瓶包裝。

1.2 主要儀器

生化培養箱、顯微鏡、革蘭氏染色儀、拍擊氏均質器、全自動微生物鑒定系統、滅菌器、生物安全柜等。

1.3 培養基及試劑

培養基分別購自北京陸橋技術股份有限公司和青島高科技工業園海博生物技術有限公司，試劑購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司,診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司。所使用的培養基、試劑和診斷血清均在有效期內，使用前都經過了質量控制[1]。

1.4 檢驗方法

GB4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[2]。

2.實驗步驟

2.1 增菌培養

無菌操作在生物安全柜內開啟玻璃瓶。準備90ml預熱至45℃的滅菌BPW:首先取20ml滅菌BPW加入檢樣瓶內，待巧克力樣品融化后加入無菌均質袋內。取20ml滅菌BPW清洗檢樣瓶，將洗液加入均質袋內，再取20ml滅菌BPW重復清洗一次，最后向均質袋內加入30ml滅菌BPW，充分均質混勻，制成1:10稀釋液。依此方法，分別對3件樣品進行前處理。36℃分別靜置培養8小時和18小時。再將培養8h和18h后的BPW前增菌液分別混合后，分別移取1ml轉種于10mlTTB和10mlSC增菌液中進行培養（每種增菌液轉種5管）。同時在檢測過程中同步代入待檢菌陽性標準菌株鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115和陰性標準菌株大腸埃希氏菌ATCC25922。

2.2 分離培養

分別用直徑3mm的接種環取上述增菌液劃線接種BS平板、XLD平板、HE平板、沙門氏菌顯色培養基，置36℃培養24h（BS平板48h）。

2.3 培養結果

3份盲樣標本都在TTB增菌的直接接種的平板有良好生長，而SC增菌的直接接種的所有平板均無典型菌落生長，根據本次質控考核樣本為沙門氏菌檢驗的提示，可從各個有典型菌落生長的平板里，每個平板挑取5個以上可疑菌落繼續進行培養和鑒定。各個盲樣標本在平板上的生長情況見表1。

表1 3份盲樣菌種在典型培養基平皿中的生長情況

2.4 生化與染色

在上述平板上分別挑取5個以上不同的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶培養基及營養瓊脂平板，置36℃培養24h，同時做革蘭氏染色。具體生化反應見表2。

表2 可疑菌株生化反應結果

根據表2顯示，0619及0018號菌初步反應符合沙門氏菌，并分別進行進一步生化反應和血清學試驗。

2.5 生化鑒定

挑取營養瓊脂斜面上純培養物，制成0.6麥氏濃度的菌懸液，用VITEK2全自動微生物鑒定系統進行生化鑒定，鑒定結果0619及0018號均為沙門氏菌，鑒定百分率 98%。

2.6 血清凝集試驗

挑取營養瓊脂上菌落做血清學試驗，A-F多價O血清強凝集；生理鹽水對照不凝集。

2.7 實驗結論

綜上所述，由生化和血清學試驗結果可知，本次盲樣考核0619及0018檢出沙門氏菌，0212未檢出沙門氏菌。

3.討論

本次盲樣考核是巧克力中沙門氏菌檢驗，采用BPW 8h和18h二次前增菌，每個增菌管接種五管，分別劃線四種不同培養基，挑取5個以上可疑菌落做生化和血清學分析，其目的避免漏檢。通過參加室間質控考核，可以提高我們的檢測能力，特別是在食源性疾患及食物中毒等監督抽檢中，可迅速準確檢出目標菌。

培養基的選擇也很重要，SC增菌培養基所轉種的平板均無可疑菌落生長，原因可能是增菌時間短及轉種操作技術不到位導致目標菌漏檢[3]。今后在日常工作中，樣品中經常含有其他雜菌，要從中分離出特定致病菌，應盡可能的多選擇幾種增菌液，多選擇幾種分離平板，多劃線平板多挑幾個可疑菌落鑒定分析，這就需要檢驗人員嚴肅認真工作態度、精密細致的觀察和熟練的操作技能[4]。

總之，日常工作中就要做好實驗室的質量控制工作，如培養基和診斷血清的驗收、儀器的保養和檢定、標準菌株的保存與傳代、實驗環境的衛生監測并注重生物安全[5]。通過本次能力驗證，及時發現了工作中存在的問題并及時糾正，實驗室水平得到了提高和完善[6]。