秸稈生物炭施用對玉米根際和非根際土壤微生物群落結構的影響

程揚，劉子丹，沈啟斌，楊小瑩，肖曉月，張太平*

1. 華南理工大學環境與能源學院，廣東 廣州 510006；2. 淡江大學水資源及環境工程學系，臺灣 25137

據農業部統計，中國每年秸稈產量約9×108t（陳玉華等，2018），如何有效利用好秸稈等農業廢棄物是諸多研究者較為關注的問題。生物炭是生物質在缺氧條件下熱解形成的富碳產物（Shen et al.，2016），具有比表面積大、孔隙結構發達、芳香化程度高、呈堿性、高C/N比（Li et al.，2016）等特點。將生物炭施用于農田土壤中能增強土壤肥力，調節土壤理化性質（Qian et al.，2013；Xu et al.，2014），同時還能改變土壤微生態，提高土壤生產力，固定土壤中的碳（Lee et al.，2010；Singh et al.，2012）并減緩溫室氣體排放（Zhang et al.，2016；Meyer et al.，2012；Xu et al.，2016）。因此，農作物秸稈炭化還田是一種秸稈資源化有效利用的新思路。

微生物群落是農田土壤生態系統中不可或缺的部分，在農田土壤生態系統循環中扮演著至關重要的作用。生物炭施用于土壤后，通過直接或間接的作用影響微生物代謝（姚玲丹等，2015），改變土壤中微生物群落組成及微生物多樣性，進而對植物生長等產生影響。因此，研究生物炭對土壤微生物群落結構以及土壤微生態的影響吸引了較多國內外學者的關注。李明等（2015）研究發現，秸稈生物炭的添加會促進紅壤性水稻土微生物的活動，增加了革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、放線菌和真菌的生物量。Dai et al.（2016）認為生物炭會對酸性稻田土壤微生物群落結構產生生物刺激，且對根際土壤微生物群落結構的影響大于對非根際土壤微生物群落結構的影響。韓光明等（2012）將生物炭施加到種植菠菜（Spinacia oleracea L.）的農田里也得到相似的結論。目前，關于生物炭與微生物群落相互作用的機制還沒有統一的說法，主要有：（1）生物炭的多孔結構為微生物提供適宜的庇護場所（Quilliam et al.，2013；Abit et al.，2012）；（2）為土壤微生物提供營養成分；（3）生物炭中含有的某些抑制成分會抑制微生物細胞活性；（4）通過改變土壤物理、化學環境（如酸堿度、土壤肥力等）來影響土壤微生物群落組成和結構；（5）影響細胞間信號傳遞過程（Ko?towski et al.，2017）等。Masiello et al.（2013）認為生物炭施入到土壤中后，影響細胞間信號傳遞的基因表達，而且實驗發現700 ℃制備的生物炭對細胞間信號傳遞的抑制作用比同質量300 ℃制備的生物炭的抑制作用高 10倍以上。Jaiswal et al.（2017）利用16S rRNA高通量測序技術探究生物炭對土壤微生物群落結構的影響時發現施加生物炭可以顯著增加微生物多樣性和功能多樣性，引起微生物活動和碳源利用的總體轉變。

目前，大部分相關研究都是從農田土壤取土后進行盆栽試驗，直接進行實際田間試驗的較少，而且大部分研究僅關注了生物炭施用對土壤微生物群落的影響，關于生物炭施用對農田土壤微生物群落功能的影響研究較少。本研究通過直接在田間進行試驗，應用 16S rDNA高通量測序技術以及PICRUSt功能預測技術探究生物炭施用對玉米根際土壤及非根際土壤微生物群落結構和功能的影響，為生物炭農業化實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物炭制備

實驗所用生物炭購買自江蘇華豐農業生物工程有限公司，原料為玉米秸稈，熱解溫度約600 ℃。使用多參數水質分析儀（DZS-708-A，上海雷磁）測定生物炭 pH（1:10，m:V），用 CHNS-O元素分析儀（Vario EL cube，德國Elementar）測定生物炭的C、H、N、S含量，通過差減法計算O的質量分數。使用電感耦合等離子體質譜儀（Agilent 7900，美國）測定生物炭中重金屬質量分數。

生物炭主要性質：pH 8.05，C質量分數為21.11%，H 0.824%，N 0.65%，S 0.089%，O 77.327%，O/C 3.663，H/C 0.039，(O+N)/C 3.694，Pb 24.9 mg·kg-1，Zn 115.6 mg·kg-1，Mn 108.4 mg·kg-1，Cu 67.8 mg·kg-1，Fe 187.4 mg·kg-1。

1.2 供試土壤性質

供試土壤采自廣東省惠州市博羅縣某生態試驗基地（北緯 23.238994°，東經 113.986145°），土壤為沖積土。根據《土壤農化分析》（鮑士旦，2008）中所述方法測定土壤含水率、pH、有機質、全氮、有效磷及速效鉀等（測3次取平均值）。

土壤基本理化性質：含水率15.09%，pH 4.93，有機質質量分數 32.60 g·kg-1，全氮 41.90 g·kg-1，有效磷 125.45 mg·kg-1，速效鉀 287.75 mg·kg-1。

1.3 試驗設計及樣品采集

玉米地生物炭試驗采用隨機區組設計，每處理組設置3個重復。每垅長50 m，寬1.6 m，垅間距0.3 m，株距 0.30 m，每穴 1株。試驗設置 C（0 t·hm-2）、B1（5 t·hm-2）、B2（10 t·hm-2）3 個生物炭添加量梯度，在玉米施基肥后7 d將生物炭施加到田間。施加生物炭后7 d、14 d、21 d分別采集玉米根際土壤（抖根法）和兩株玉米之間的非根際土壤（五點取樣法），分別以 rC.1～rC.3、rB1.1～rB1.3、rB2.1～rB2.3 代表 C（0 t·hm-2）、B1（5 t·hm-2）、B2（10 t·hm-2）3個生物炭處理后第7天、14天、21天的根際土壤樣品，以 C1～C3、B1.1～B1.3、B2.1～B2.3代表3個生物炭處理后第7天、14天、21天的非根際土壤樣品。挑除土壤中的動物殘體、植物殘根、石塊等雜志后，將一部分土壤樣品（約30 g）保存于放有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室后立即存于-80 ℃冰箱中，供微生物分析用，另一部分土壤樣品儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.4 實驗方法

14.1 土壤樣品細菌16S rDNA擴增

分別取根際土壤和非根際土壤樣品，利用DNA提取試劑盒提取樣品中的總 DNA。進行基因組DNA抽提后，利用 ω=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性、純度和濃度。以宏基因組DNA為模板，根據測序區域細菌V4區域的選擇，使用帶barcodearcode arcode的特異引物（515F-806R）進行 PCR 擴增。擴增體系（50 μL）如下：2x Premix Taq 25 μL；Primer-F（10 mmol·L-1）1 μL；Primer-R（10 mmol·L-1）1 μL；DNA（20 ng·mL-1）3 μL；Naclease-free water 20 μL。每個樣本進行3個重復，并將同一樣本的 PCR產物進行混合，PCR儀：BioRad S1000（Bio-Rad Laboratory，CA）。擴增結束后，用ω=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的片段長度和濃度，利用GeneTools Analysis Software（Version 4.03.05.0，SynGene）對PCR產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將PCR產物進行混合。使用 EZNA Gel Extraction Kit（Omega，USA）凝膠回收試劑盒回收 PCR混合產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

1.4.2 建庫及測序

按照 NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標準流程進行建庫操作，使用Illumina Hiseq 2500平臺對構建的擴增子文庫進行PE 250測序。

1.4.3 數據分析

運用R軟件包進行OTU各個分類等級相對豐度的統計及物種相對豐度熱圖的繪制；運用USEARCH軟件進行樣本間和物種的聚類分析；KRONA軟件對單個樣本的物種注釋結果進行可視化；運用GraPhlAn軟件得到基于GraPhlAn的單個樣本的OTU注釋圈圖；運用Qiimme軟件包中的Alpha_diversity.py腳本進行 Alpha多樣性指數分析；運用Qiimme 2和Ggplot 2軟件包進行PCoA分析并繪圖；運用PICRUSt軟件對微生物群落結構功能進行預測分析；運用R軟件包進行熱圖繪制；運用SPSS 22.0進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 土壤微生物OTUs及Alpha多樣性分析

表1所示為玉米根際土壤及非根際土壤微生物OTUs數量及Alpha多樣性指數。由表可知，相比于空白組，施加生物炭后，玉米非根際土壤樣品測得的OTUs數量隨時間推移逐漸增加，說明其物種多樣性增大。生物炭施加量為5 t·hm-2（B1）處理組對微生物群落多樣性的增加效果更明顯，施加生物炭后21 d樣品中OTUs數相比于7 d時增加了174.56%，高于施加量為10 t·hm-2處理組（B2）的增長率（31.25%），說明生物炭施加量是導致土壤微生物群落發生改變的一個重要因素，該結果與Dempster et al.（2012）的研究結果一致。生物炭的施入影響土壤的物理化學性能，如土壤酸堿度、有機質含量、全氮、硝態氮、銨態氮、C/N比、速效磷、速效鉀以及土壤濕度等，提高土壤的營養成分（Chathurika et al.，2016；蓋霞普等，2016），從而使得微生物群落多樣性發生變化。

表1 土壤微生物OTU數量及Alpha多樣性指數Table 1 The number of OTUs and Alpha diversity index of soil microbial

就玉米根際土壤而言，生物炭的施加對其微生物群落多樣性無顯著影響（P=0.177），施加生物炭21 d后空白組（rC）和實驗組（rB1、rB2）的OTUs數量均在2000左右。此結果與Dai et al.（2016）的研究結果存在一些差異，可能與生物炭類型以及根際土壤中存在的植物根系分泌物對微生物群落的影響遠大于生物炭對其產生的影響等有關。時間對根際土壤微生物群落多樣性變化存在顯著影響（P=0.002），3個處理組的OTUs數量均隨時間推移而顯著增大。

Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包含物種組成的豐富度和均勻度兩個因素，本研究中采用Chao1指數和Shannon指數進行分析。

Chao1指數可反映樣品中群落的豐富度，即群落中物種的數量。根據表1，對比空白對照組，玉米非根際土壤在施加生物炭后微生物群落豐富度明顯增加，且施加量為 5 t·hm-2比施加量為 10 t·hm-2對提高微生物群落豐富度的刺激作用更明顯，21 d后生物炭施加量為5 t·hm-2的處理組（B1）chao1指數達到了2707。推測原因可能是：生物炭可以降低土壤酸度（Smebye et al.，2016），且生物炭中含有的營養元素可以被微生物利用，為微生物提供適宜的生存場所等。同時適量的生物炭會刺激微生物代謝，使得微生物群落物種豐富度增加，而生物炭中的某些重金屬離子以及活性有機化合物等也會抑制微生物的生命代謝活動（Zhu et al.，2017），當施加量為10 t·hm-2時，生物炭中的金屬離子（Pb2+、Cu2+等）等無機鹽對微生物代謝的抑制作用變得明顯，使得微生物群落物種豐富度增加效率受到限制。

Shannon指數可估算樣本中微生物多樣性，其值越大表示群落多樣性越高。根據表 1，施加生物炭后21 d玉米非根際土壤樣品Shannon指數分別為8.654、7.864，均高于同時期的空白組（Shannon指數為4.522），說明施加生物炭會促進土壤微生物多樣性的增長。從時間上看，往土壤中添加生物炭后，空白組（C）和處理組（B1、B2）的Shannon指數在7～14 d階段增長較快，14～21 d略有下降，對應的微生物多樣性也是先升高后略有降低。就根際土壤而言，施加生物炭 21 d后各處理土壤樣品的Shannon指數比較接近，可能與玉米根系分泌物對微生物多樣性的影響以及生物炭施加方式（施加到兩株玉米之間）有關。

2.2 土壤微生物在門水平的物種相對豐度分布

圖1 門水平上根際土壤及非根際土壤物種相對豐度分布Fig. 1 Relative abundance distribution of species in rhizosphere and bulk soils at phylum level

玉米根際土壤與非根際土壤樣品在門水平上相對豐度大于1%的古菌和細菌群落組成如圖1所示。由圖可知，相對豐度大于1%的物種有15種，分別為泉古菌門（Crenarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、OD1、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、[Thermi]，這些古菌和細菌構成了研究區玉米土壤中門水平上的微生物群落基本結構。

在玉米非根際土壤及根際土壤中，優勢菌群均為變形菌門（Proteobacteria），占比為27.21%～72.00%。變形菌門作為細菌中最大的門類，包括諸如大腸桿菌（T. Escherich 1885）、沙門氏菌（salmonella）等在內的諸多病原菌。根際土壤中變形菌門相對豐度（占21.21%～56.64%）較非根際土壤（占36.08%～72.00%）低，原因是根系分泌物會抑制變形菌門的生長（羅永清等，2012）。施加生物炭21 d后，非根際土壤中變形菌門相對豐度相比于施加生物炭7 d時的相對豐度均有所降低，且兩個處理組（B1，B2）變形菌門相對豐度均低于空白對照組（C）。這說明施加生物炭會抑制變形菌門活性，進而降低相關病原菌的相對豐度，利于玉米作物的生長。就根際土壤而言，施加生物炭對變形菌門相對豐度無顯著影響（P=0.051），空白對照組（rC）和處理組（B1、B2）土壤樣品中變形菌門相對豐度均隨時間推移而降低，這可能是由于在玉米根際土壤中，相比于生物炭對微生物的影響，根系分泌物對微生物的影響起主導作用。

酸桿菌是土壤中的一類重要菌群，在土壤中可降解植物殘體，參與鐵循環、單碳化合物代謝以及光合作用等物質循環和生態環境構建過程（王光華等，2016）。本研究中，施加5 t·hm-2生物炭后玉米根際土壤酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度提高，但施加10 t·hm-2生物炭時酸桿菌門相對豐度降低，這可能與施加生物炭引起的土壤理化性質的改變（Huang et al.，2017），以及生物炭中含有的金屬元素對酸桿菌門活性的抑制作用等有關。

2.3 土壤微生物在科水平的物種相對豐度分布

圖2 科水平上根際土壤及非根際土壤物種相對豐度分布Fig. 2 Relative abundance distribution of species in rhizosphere and bulk soils at family level

圖2所示為科水平上玉米根際土壤及非根際土壤物種相對豐度分布圖。由圖可知，玉米非根際土壤中以黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）為優勢種，占整個微生物群落的50%以上。黃單胞菌科隸屬于變形菌門。施加生物炭后，非根際土壤黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）明顯受到抑制，施加21 d后處理組B1和B2的黃單胞菌科相對豐度分別從施加7 d后的57.50%和29.12%降至13.02%和16.68%，均低于空白對照組（55.62%）。該趨勢與變形菌門在非根際土壤中的變化趨勢一致。

在玉米根際土壤中，黃色單胞菌科相對豐度較低，空白組（rC）和實驗組（rB1、rB2）中相對豐度均低于 10%，這可能與根系分泌物抑制致病菌生長等有關（羅永清等，2012）。施加生物炭與否及施加量多少對根際土壤黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）豐度高低的影響不顯著（P=0.857），該結果與根際土壤中變形菌相對豐度變化趨勢一致。

從圖3還可知，施加生物炭后，隨時間推移，玉米非根際土壤中的微生物群落中未被定義的微生物相對豐度增加，說明生物炭的施入會更明顯地誘導非根際土壤中微生物群落結構發生改變。

2.4 土壤微生物主成分分析

根據樣本的 OTU豐度信息計算 Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離并構建矩陣，據此進行多變量統計學方法主坐標分析（PCoA），評估施加生物炭對玉米根際及非根際土壤微生物群落結構的影響（圖3）。

由圖3可知，主要成分1（PC1）和主要成分2（PC2）是造成不同樣品間差異的最主要特征，貢獻率分別為19.26%和15.46%。就玉米非根際土壤而言，施加生物炭可明顯改變土壤微生物群落結構，施入生物炭后非根際土壤處理組（B1、B2）與空白組（C）之間在PC2上相距較遠，說明施加生物炭后非根際土壤微生物群落結構發生改變。施加生物炭對玉米根際土壤則沒有顯著的影響，施入生物炭21 d后空白組（rC.3）和處理組（rB1.3、rB2.3）沒有顯著差異，在PC1和PC2上均相距較近，說明生物炭施加對玉米根際土壤微生物群落影響較弱。PCoA分析結果與上述OTUs聚類、Alpha多樣性分析以及門、科水平上物種相對豐度結果一致。

2.5 PICRUSt功能預測分析

PICRUSt是基于KEGG宏基因組預測微生物群落功能的工具（Langille et al.，2013），通過將微生物群落的相對豐度與數據庫進行比對，在無法直接觀測的情況下推測微生物群落結構的功能信息（Li et al.，2017）。本研究利用PICRUSt程序來探究施加生物炭對玉米根際及非根際土壤微生物群落基因功能的影響。

圖3 根際土壤及非根際土壤樣品PCoA分析Fig. 3 PCoA analysis of rhizosphere and bulk soils

利用PICRUSt對基于KEGG pathyway（LV3）的基因功能進行預測，共發現6910個預測的功能。圖4所示為預測的前30種功能熱圖，分別是其他功能，丙酮酸代謝，轉錄因子，ABC轉運體，氨基糖和核苷酸糖代謝，轉錄機器，原核生物中的碳固定途徑，精氨酸和脯氨酸代謝，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨酰-tRNA生物合成，甲烷代謝，糖酵解/糖異生，蛋白酶，一般功能預測，嘌呤代謝，氧化磷酸化，嘧啶代謝，核糖體，氨基酸相關的酶，轉運因子，其他離子偶聯的轉運體，未知功能，雙組分系統，細菌運動蛋白，分泌系統，DNA修復和重組蛋白，核糖體生物合成，染色體，分子伴侶和折疊催化劑。這些代謝通路隸屬于代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、細胞過程、有機體系、人類疾病等六大類代謝通路（LV1）。

通過PICRUSt基因預測聚類熱圖，可看出施加生物炭后微生物群落基因功能產生差異。施加生物炭后，玉米非根際土壤微生物群落的丙酮酸代謝、轉錄因子、ABC轉運體等功能作用明顯增強，氨基糖和核苷酸糖代謝，轉錄機器，原核生物中的碳固定途徑，精氨酸和脯氨酸代謝，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨酰-tRNA生物合成，甲烷代謝，糖酵解/糖異生等過程的作用也有所增強；而未知功能、雙組分系統、細菌運動蛋白、分泌系統、DNA修復和重組蛋白、核糖體生物合成、染色體、分子伴侶和折疊催化劑等過程作用則有所減弱。在玉米根際土壤中，生物炭施用對微生物群落相關通路的影響則不同。

根據預測結果，生物炭的施入影響了玉米土壤微生物群落相關功能基因的豐度進而影響微生物群落的生長代謝、信息傳遞等過程。

3 結論

（1）生物炭施加到土壤后，在門和科水平上對玉米非根際土壤微生物群落的相對豐度及多樣性產生了較大的影響，非根際土壤微生物群落的相對豐度和多樣性明顯提升，而根際土壤微生物群落的相對豐度及多樣性變化較小。空白對照組和施炭實驗組玉米根際土壤微生物群落多樣性及相對豐度均隨著時間推移而增加。

圖4 PICRUSt基因預測聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of PICRUSt gene predict function

（2）玉米根際土壤中，施加5 t·hm-2生物炭后酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度升高，當施加10 t·hm-2生物炭時酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度降低。施加生物炭后，玉米非根際土壤中黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）相對豐度明顯降低，同時部分未被定義微生物相對豐度明顯增加；在生物炭施加對根際土壤微生物的影響不顯著（P=0.857）。

（3）PICRUSt預測結果表明，生物炭施入玉米土壤后會影響土壤微生物群落的基礎生命功能及與周圍環境的信息傳遞過程等，進而影響微生物在土壤環境中的生態效應。