堿蓬修復黃河三角洲原油污染土壤試驗研究

于一雷 ，馬牧源 *，徐衛剛 ，郭嘉 ，李勝男

1. 中國林業科學研究院濕地研究所，北京 100091；2. 濕地生態功能與恢復北京市重點實驗室，北京 100091

世界上很多重要濕地都分布有油田，如美國路易斯安娜油田、黑海油田、中國勝利、大慶、遼河和大港油田都位于濕地內。然而，石油開發過程中的落地油、漏油和溢油以及鉆井泥漿和洗井廢水排放等嚴重威脅著濕地生態系統安全（程國玲等，2007）。石油污染物會堵塞土壤孔隙，引起板結，改變土壤有機質與氮磷的比值（陸秀君等，2003），影響植物根系生理活動、抑制植物生長；與此同時，大多數石油污染物具有致癌、致畸和致突變作用（Jia et al.，2017；劉五星等，2006），進入土壤的石油污染物還會通過滲透作用污染淺層地下水（劉五星等，2006）。

黃河三角洲是中國最具代表性的濱海濕地之一，也是中國第二大油田——勝利油田的產油區，石油污染已成為本區濕地生態系統退化的重要影響因子（于君寶等，2012）。其中，孤東和勝坨油田等附近土壤（石油類含量大于500 mg·kg-1）（劉慶生等，2003；劉五星等，2007；王久瑞等，2002）和水體的石油污染較重（劉峰等，2012）。因此，開展植物對石油污染降解作用及過程的研究，對石油污染問題的解決以及濕地生態功能恢復具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植物、原油、試劑和土壤

原油取自孤東油田，其組成為：飽和烴含量482 g·kg-1，芳香烴含量 27.8 g·kg-1，膠質 12.5 g·kg-1和瀝青質11.4 g·kg-1。試驗分析過程中的三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷均為分析純級，層析所用的試劑主要為硅膠和氧化鋁（100～200目）。

土壤采自黃河三角洲背景值土壤（未受到石油污染），其基本理化性質為：pH7.60，全鹽 5.74 g·kg-1，銨態氮含量 1.09 mg·kg-1，硝態氮含量 7.86 mg·kg-1，總有機質含量 4.14 mg·kg-1。土壤過 100目篩子后風干備用。供試堿蓬（Suaeda salsa）種子采自黃河三角洲。

1.2 試驗設計

研究表明，上世紀 80—90年代黃河三角洲孤東油田土壤中石油污染的背景值為67.22 mg·kg-1，土壤中石油烴平均值為235.56 mg·kg-1（王景華等，1989；趙善倫等，1995）；2001年時孤東和勝坨油田附近土壤石油烴質量分數大于500 mg·kg-1，其中孤東油田土壤中石油烴質量分數最高值為 700 mg·kg-1（劉慶生等，2003）；2006年以來，研究發現油井周圍100 m范圍內土壤石油烴質量分數大多數高于500 mg·kg-1，溢油區油泥石油烴質量分數高達6320 mg·kg-1，油區土壤均遭受不同程度的石油污染，區域內受石油污染的土壤面積占總面積的24%（何慶成等，2006；王傳遠等，2009）。

植物對土壤中石油烴的降解作用受石油烴濃度影響較大，高濃度石油明顯抑制植物生長及微生物活性，研究表明，當土壤中石油烴質量分數為40 g·kg-1左右時，其生物降解率接近最低（Almeida et al.，2013）。因此，基于黃河三角洲實際污染水平和前人研究結果，本研究設置3個石油污染水平，分別為2、4和6 g·kg-1，分別代表為低、中和高污染水平。盆栽用的花盆盆口直徑和高度均為20 cm，每個花盆中裝入4 kg風干土壤。首先將石油烴溶解至石油醚（沸點范圍為30～60 ℃）中，再與土壤充分混合均勻，裝入花盆，然后靜置 2 d，期間多次攪拌，以使石油醚充分揮發。已有研究表明，將其置于室內通風櫥中或在室外攪拌靜置，均可使石油醚完全揮發（魯莽等，2009；于君寶等，2012），排除石油醚的干擾作用。

供試植物為堿蓬，每個處理設置3個重復（表1），以未種植堿蓬的石油污染土壤作為對照處理，用于研究無植物作用下石油自然衰減特征。首先，精選堿蓬種子，每盆稱取0.7 g，采用1%高錳酸鉀溶液消毒半小時，然后用蒸餾水沖洗干凈后播種（于君寶等，2012；Zhang et al.，2010）。在黃河三角洲東營市鹽生植物園室外布置盆栽試驗，2015年5月進行盆栽播種，出苗后10 d（幼苗相對茁壯之時）開始間苗和定苗，每盆保持 45棵。根據堿蓬不同生育期進行定量澆水，相同時期所有處理保持澆水量一致。每月測定堿蓬株高，采用直徑為1 cm的微型半圓鑿土鉆采集根際附近土壤樣品，用于理化性質和微生物種類分析。

表1 試驗設計Table 1 The design of experiment

1.3 分析方法

土壤石油烴測定：稱取風干土壤樣品10 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL三氯甲烷，加蓋密封。搖動5 min，放置過夜。次日，置于55 ℃水浴中熱浸，同時進行超聲萃取，歷時1 h，然后將離心管放入離心機進行高速分離（4500 r·min-1，離心5 min），過濾，收集上清液。重復熱浸超聲萃取2次，過無水硫酸鈉，冷卻干燥。依據石油天然氣行業標準（SY/T5119—2008巖石中可溶有機物及原油族組分分析）（中華人民共和國國家發展和改革委員會，2008），利用層析技術對石油中烷烴、芳香烴和極性物質進行分離。通過正己烷連續潤洗硅膠-氧化鋁層析柱，將萃取后的石油過層析柱，其中極性物質被氧化鋁吸附。層析柱用30 mL正己烷反復淋洗，然后收集淋洗出的烷烴組分，再用 30 mL（體積比為65:35）二氯甲烷與正己烷的混合試劑反復淋洗，收集芳烴組分，最后用30 mL三氯甲烷反復淋洗并收集極性物質，過無水硫酸鈉，冷卻干燥。采用稱重法測定石油類污染物總量及各族組成含量。

微生物樣品分析：現場采集土壤新鮮樣品，立刻用液氮冷凍保存，然后用干冰保存樣品送往實驗室進行DNA提取，基于Miseq平臺測序得到的PE reads，根據 overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣品后進行 OTU聚類分析和物種分類學分析。基于 OTU分析物種多樣性指數以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構統計分析和可視化分析。

2 結果與分析

2.1 堿蓬株高變化

不同石油污染水平下盆栽堿蓬的平均株高變化見圖1。由圖可知，在3種石油污染水平下，盆栽堿蓬均萌發、存活且保持生長。

圖1 堿蓬株高變化Fig. 1 The variation of Suaeda plant height

低污染水平（C1）處理6月堿蓬株高最低值為2.3 cm，10月最高值為60.0 cm，低污染水平處理的3個重復每盆株高生長趨勢類似，但是8月后第一個重復（P2C1-1）平均株高高于另外兩個重復。中污染水平（C2）處理6月堿蓬株高最低值為2.3 cm，10月最高值為15.0 cm。高污染水平（C3）處理 6月堿蓬株高最低值為 2.1 cm，最高值為 12.0 cm。中、高污染水平處理中各自的3個重復的株高變化趨勢基本一致。低污染水平條件下堿蓬株高數據的變異系數為 96%，明顯高于中和高污染水平（50%和53%），且后兩者數值接近，低污染水平條件下變異系數高的原因在于第一個重復盆內有幾株堿蓬株高明顯高于其他堿蓬。6月份3種污染水平條件下株高無顯著差異（P=0.329，0.103，0.423；n=3），7—10月低污染水平條件下的每盆株高均顯著高于中（P=0.013，0.002，0.044，0.006；n=3）、高污染水平（P=0.001，0.001，0.035，0.004；n=3），其中，除7月份中污染水平的株高顯著高于高污染水平株高外（P=0.008；n=3），其他月份均無顯著差異。結果說明，堿蓬對石油污染土壤具有耐受或是降解能力，生長初期不同濃度石油對堿蓬株高影響不顯著，生長后期中高濃度石油對堿蓬株高影響作用明顯。

2.2 堿蓬生物量及主根系長度

盆栽堿蓬的生物量（干重）能反映其在不同石油污染水平條件下的最終生長狀態。植物對污染物的降解作用主要集中在根系附近，生物量和主根長度均能反映堿蓬對石油污染的降解能力。不同石油污染水平處理條件下堿蓬干重和主根長度對比見圖2。

圖2 3種石油濃度處理的堿蓬生物量及主根長度Fig. 2 The biomass and main root length of Suaeda under three crude oil concentration treatments

低污染水平條件下堿蓬的生物量變化范圍為16.79～166.00 g·pot-1，重復 1（P2C1-1）的生物量遠高于其他兩個重復是最明顯的特點。這與圖1中株高的變化是一致的。中污染水平條件下生物量范圍為1.53～5.86 g·pot-1，高污染水平條件下生物量范圍為1.61～2.55 g·pot-1。低、中和高污染水平條件下3個重復生物量變異系數分別為111、56和23，進一步說明低污染水平條件下生物量較大差異。低污染水平堿蓬生物量顯著高于中和高污染水平的（P=0.030；n=3），且后兩者之間無顯著差異（P=0.958；n=3）。這表明中、高污染水平顯著抑制了堿蓬生物量的增加。低濃度條件下重復1的主根系長度最大，達到13.9 cm，最低值為2.2 cm。3種污染水平處理的主根系長度平均值之間均無顯著差異（P=0.130；n=3）。除去最高值之外，說明堿蓬根系能起到降解作用的平均深度在3.3 cm左右。石油污染水平升高明顯抑制了生物量的增加，但是對根系沒有起到明顯影響作用，主要表現為對堿蓬地上部分的影響。

圖3 不同處理中總石油烴濃度時間變化Fig. 3 The temporal variation of crude oil concentration in different treatments

2.3 石油烴濃度變化

2.3.1 總石油烴

為研究堿蓬對石油污染的降解效果，以無堿蓬種植（P0）的不同石油污染處理作為對照，分別設置3個對照處理。石油烴質量分數-時間變化見圖3。

圖4 不同處理中飽和烴和芳香烴濃度時間變化Fig. 4 The temporal variation of saturated hydrocarbon and aromatic hydrocarbon under different treatments

由圖3可知，堿蓬處理中石油質量分數均低于對照處理，且表現為下降趨勢。在8—10月，總石油烴質量分數降低幅度較大，這與堿蓬的快速生長變化是一致的。與對照處理相比，堿蓬均能顯著降低土壤中石油總質量分數（P=0.001；n=3）。對照處理中總石油烴質量分數的降低可能是由于自然揮發或是土壤中微生物的降解作用所導致。扣除對照處理中自然降解的石油烴含量后，計算得到殘留在低、中和高污染水平處理土壤中總石油烴質量分數分別為0.95、1.28和2.00 g·kg-1。進一步計算得出低、中和高污染水平處理下，堿蓬對總石油烴的降解率分別為47.5%、32.0%和33.30%。由此可知，在低污染水平條件下堿蓬對石油烴的降解效果最好，且中污染水平和高污染水平效果較為接近。

2.3.2 飽和烴、芳香烴、瀝青質和膠質

飽和烴、芳香烴、瀝青質和膠質為石油的主要組成部分。不同處理中石油組成分項的變化見圖 4和圖5。

圖5 不同處理中瀝青質和膠質濃度時間變化Fig. 5 The temporal variation of asphaltene and colloid concentration under different treatments

由圖4可知，石油中各組分大小順序為：飽和烴＞瀝青質＞芳香烴＞膠質。對照處理中石油各組分均表現為降低趨勢，這是由于自然揮發或土壤中微生物的降解作用所致。隨著堿蓬的生長，降解作用明顯，飽和烴和芳香烴的質量分數均明顯降低。堿蓬處理中，低和中污染水平下飽和烴質量分數均表現為9月明顯降低，10—11月時變化較為緩慢；高污染水平下 10月飽和烴質量分數明顯降低。低污染水平條件下飽和烴降至0.78 g·kg-1，堿蓬對飽和烴的降解率為29.50%；中污染水平下飽和烴下降至1.87 g·kg-1，降解率為22.73%；高污染水平下飽和烴下降至2.04 g·kg-1，降解率為28.22%。芳香烴在總石油烴構成中的占比不是很大，但芳香烴卻屬于最難降解的部分。與對照處理相比，3種處理中芳香烴質量分數均降低，尤其是在中污染水平條件下7—9月急劇降低。低、中和高污染水平處理下，堿蓬對芳香烴的降解率分別為 38.61%、47.54%和30.89%。

圖5所示為瀝青質和膠質的時間變化特征。堿蓬處理中，3種石油污染水平下瀝青質質量分數均明顯下降，對照處理中低污染水平時瀝青質變化不大，而在中和高污染水平下瀝青質均明顯降低，尤其是高污染水平處理。膠質方面，3種污染水平條件下膠質質量分數最終都降低至檢測限，其中高污染水平石油處理的膠質質量分數基本上都在檢測限以下。高污染水平處理下膠質的自然降解速率非常快。瀝青質和膠質質量分數在 8—9月時出現明顯降低。低、中和高污染水平下堿蓬對瀝青的降解率分別為32.39%、51.96%和51.00%，這表明堿蓬對難降解的瀝青質有較好的降解效果。

3 討論

3.1 堿蓬生理特征與石油降解過程

綜合堿蓬株高（圖1）和總石油烴（圖3）變化特征得出，5—7月時為堿蓬萌芽及緩慢生長期，8—9月為快速生長期，10月以后株高穩定，對應的土壤中總石油烴含量水平變化為緩慢降低、快速降低和緩慢降低 3個階段，可以明顯看出在堿蓬在快速生長期對石油烴的降解速率較快。于君寶等（2012）研究表明，石油對堿蓬幼苗株高和葉片數的影響顯著，石油污染水平越高抑制作用越明顯。其研究結果可解釋本研究中前期的緩慢增長，以及后期相對減弱的抑制作用。幼苗期后堿蓬可通過增加抗氧化酶、增加葉綠素含量等提高對石油逆境的抵御能力（高乃媛等，2013）。與堿蓬同屬于藜科（Chenopodiaceae）的鹽生植物海蓬子（Salicornia europaea）對鹽堿土壤中的原油污染具有較高的降解率，且優于單獨的銅綠假單胞菌降解處理（Ebadi et al.，2018）。另外，也有研究開展重石油污染濃度（高達47.1 g·kg-1）的植物降解試驗，結果表明植物均顯示出高生存率和活力，但并未顯著提高總石油烴降解效果（Pérez-Hernández et al.，2016）。

根系在降解過程中起主要作用，根系本身及其附近微生物的協同促進作用使得根際附近的石油烴降解效率高（魯莽等，2009）。本研究中除一個重復的主根系長達13.9 cm之外，平均根系長度為3.3 cm，說明該長度為堿蓬降解的主要深度范圍。有研究發現，在石油烷烴降解過程中，烷烴在堿蓬中的分布特征表現為根＞莖＞葉，且初期根系的富集能力較強，后期有所降低（高乃媛等，2013）。堿蓬生長進入花果期后，其根系生長變慢，吸收作用減弱，相應地，降解能力也減弱（王蓓等，2007）。許崇彥等（2007）研究發現，與對照相比，堿蓬對鹽堿土壤中石油烴的降解率為 21%～37%。本研究結果低石油污染水平下的降解率為47.5%，中水平下為32.0%，高水平下為33.30%。對比發現兩者降解效率比較接近。海蓬子與銅綠假單胞菌接合措施顯著提高了降解率，其中對長鏈烷烴（C20以上）的降解強度最大（Ebadi et al.，2018），雖然植物和菌種類型不一致，但其結果與本研究中堿蓬對烷烴降解作用較大的結果一致（圖4～圖5）。

3.2 根際微生物

由圖6(a)可知，在低、中原油污染水平下，堿蓬處理的香農指數略高于對照處理，但是均并未達到顯著水平（低：P=0.918，n=3；中：P=0.584，n=3）；高污染水平下堿蓬處理的香農指數低于對照處理，差異未達到顯著水平（P=0.209；n=3）。王梅等（2010）研究表明，低石油污染有可能刺激了細菌數量的增加，隨著濃度升高，微生物多樣性會降低。本研究中，石油污染水平的變化對優勢種群的影響較小。低、中污染水平處理中細菌多樣性的增加，在于堿蓬根系附近的輸氧作用以及根系分泌物養分作用的影響；高污染水平處理的環境脅迫作用導致堿蓬根系附近細菌多樣性降低。這也說明堿蓬對原油的降解作用可能與微生物共同起作用。

圖6 不同處理土壤中微生物Shannon指數和微生物相對豐度Fig. 6 Microbial Shannon index and relative abundance of microorganisms in soils under different treatments

由圖6(b)中可知，所有處理中Proteobacteria（蛋白菌，屬于變形菌）相對豐度均較高，豐度為30%～40%；Chloroflexi（綠彎菌）豐度為20%左右，Actinobacteria（放線菌）為15%左右，Acidobacteria（酸桿菌）豐度為 15%左右。堿蓬處理并未顯著提高土壤微生物豐度。低污染條件下：與對照相比，Proteobacteria相對有所降低、Chloroflexi（綠彎菌）變化不明顯、Sacchairbacteria升高、Actinobacteria略微升高。中污染條件下各細菌相對豐度變化不大。高污染條件下：Acidobacteria豐度降低、Sacchairbacteria豐度升高、Actinobacteria豐度降低。高污染條件下堿蓬處理中 Mycobacterium、C1-B045顯著低于對照，而Desulfuromonas則高于對照。

在勝利油田灘涂區，韓平等（2009）篩選出對石油烴降解率大于90%的γ-變形菌，它能降解大部分C12～C26的石油烷烴。在勝利油田采油井附近的砂質壤土中也發現變形菌為其優勢菌群（Liao et al.，2015；Gao et al.，2015），與本研究結果一致。有研究發現，α-變形菌綱紅螺菌是石油污染土壤中的優勢菌，且在好氧環境下是降解多環芳烴的優勢菌（Zhang et al.，2012）。土壤環境的差異，造成能降解石油污染的土著菌群明顯不同，在尼日利亞三角洲污染場地中發現，除變形菌外還有8種降解細菌屬（Chikere et al.，2017）；從阿爾及利亞瓦格拉市砂質土壤中分離出鏈霉菌屬，發現7 d內其對石油的去除率達到98%，其中對正構烷烴（C6～C30）、芳族和多環芳烴的降解率高，同時此菌株還能促進植物生長（Baoune et al.，2017）；在尼日利亞污染超過 10年的原油井周邊篩選出的根際真菌與大黍（Panicum maximum Jacq.）對總石油烴的協同降解率達到40%（Asemoloye et al.，2017）。也有研究表明，盆栽條件下微生物增強根際的處理與非根際和對照相比，土壤脫氫酶活性增加，且明顯提高了對總石油烴、芳香烴的降解效果（Dhote et al.，2017）。

3.3 石油降解的指數擬合

運用一級衰減方程Nocentini et al.（2000）來描述土壤中總石油烴含量的降解速率，基于Origin分析軟件，扣除對照處理的石油烴自然衰減含量后，對堿蓬在3種污染水平條件下的石油降解過程進行非線性指數回歸模擬，結果見圖7。

3種濃度下堿蓬對總石油烴降解的擬合曲線的R2分別為0.99、0.97和0.70，降解速率常數K分別為0.19、0.12和0.11。3個曲線擬合結果均較好，其中低污染水平下的擬合效果最好，降解速率常數最高。由此表明，高污染條件下，石油烴對堿蓬的脅迫作用強，而低污染條件下脅迫作用較弱，因此堿蓬及根際微生物對石油的協同降解效果較好（許崇彥等，2007；Liste et al.，2000）。

4 結論

圖7 石油烴降解的非線性指數回歸擬合Fig. 7 Nonlinear index regression fitting of crude oil degradation

室外盆栽條件下堿蓬在原油污染水平為 2～6 g·kg-1的土壤中均能萌發、存活和生長，且低水平時株高、生物量及主根系長度高于其他水平處理。5—7月時為堿蓬緩慢生長期，8—9月為快速生長期，10月以后株高穩定。同時，土壤中原油含量水平變化分為緩慢降低、快速降低和緩慢降低3個階段，與生長期具有一致性。堿蓬在快速生長期對原油的降解速率高，其中堿蓬根際為主要降解作用發生區。

低、中和高污染水平處理下堿蓬對石油烴的降解率分別為38.61%、47.54%和30.89%，其中對原油中飽和烴的降解作用較大。試驗處理中變形菌的豐度最高，其次為綠彎菌、放線菌和酸桿菌，均為降解石油烴菌群。高污染水平石油烴對堿蓬的脅迫作用強，而低水平脅迫作用較弱，同時堿蓬及根際微生物對石油的協同降解效率高。堿蓬處理并未顯著提高土壤中微生物的豐度，但是堿蓬與微生物可能起到協同降解作用，具體機理需要進一步研究。